乙型肝炎病毒标志物检测方法的选择与应用

梁金明，陈 聪，欧志莲，陈康荣，梁惠明，唐家玉

（湛江中心人民医院，广东湛江524037）

乙型肝炎病毒标志物检测方法的选择与应用

梁金明，陈 聪，欧志莲，陈康荣，梁惠明，唐家玉

（湛江中心人民医院，广东湛江524037）

目的探讨乙型肝炎病毒定性与定量方法在临床诊治中的应用价值和合理选择。方法收集920例健康体检者血清，分别用胶体金方法、酶联免疫吸附剂测定方法和时间分辨免疫荧光方法检测乙型肝炎病毒表面抗原，对阳性标本再用中和确认试验进行验证和PCR方法检测HBV-DNA。结果920例标本中胶体金法检出阳性96例，酶联免疫吸附测定方法检出阳性104例，时间分辨免疫荧光法检出阳性112例，时间分辨免疫荧光方法与胶体金方法、酶联免疫吸附测定方法比较有统计学意义（P＜0.001、P=0.008）；中和确认试验确认112例标本均阳性；实时荧光定量PCR检测112例标本HBV-DNA阳性78例。结论乙型肝炎病毒标志物的日常检测方法应由准确性高的定量方法替代目前常用的定性方法。

乙型肝炎病毒；检测方法；胶体金方法；酶联免疫吸附剂测定方法；时间分辨免疫荧光方法；聚合酶链反应

乙型肝炎病毒（HBV）是最常见的一种感染性病毒，因其传染性及病毒本身的耐受性强，危害比较大，在我国和世界都是一个不可忽视的公共卫生问题，特别在发展中国家，全世界约有4亿感染者［1］，在我国也曾有过很多争议。所以不管是住院病人、门诊病人还是体检，都会检测乙型肝炎二对半，而对于这个病毒的检测方法则不胜枚举，最常见的有酶联吸附试验（ELISA）、时间分辨法免疫荧光方法（TR-FIA）、化学发光法（CLIA）、胶体金法（colloidal gold）、分析金标免疫层析法（GICA）等，还有与其相关的HBV-DNA、前S1抗原、基因分型等。

乙型肝炎病毒检测方法有定性与定量二类，定性方法中最常用的是ELISA方法，而快速检测方法或即时检验（POCT）也是定性方法，常用的是胶体金方法或分析金标免疫层析检测技术；定量方法最常用的是时间分辨免疫荧光方法和化学发光方法等。

本研究随机从体检人群中选标本920例，分别用快速的胶体金方法、目前最常用的ELISA定性方法和定量的时间分析免疫荧光方法，检测乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg），对阳性标本进行中和确认试验进行确认及用聚合酶链反应（PCR）检测HBV-DNA，对结果进行分析和比较。

1 材料与方法

1.1 标本收集与处理每周随机选择一天在健康体检者92例，共选10d（共920例），收集当天体检标本血清，分别用胶体金方法、酶联免疫吸附剂测定方法和时间分析免疫荧光方法检测乙型肝炎病毒表面抗原，对阳性标本再用中和确认试验进行验证和检测HBV-DNA。

1.2 仪器及试剂

1.2.1 仪器新波生物EasyCuta 1260，爱康URANUS AE150，达安DA7600PCR分析仪。

1.2.2 试剂艾博生物医药（杭州）有限公司生产的HBsAg胶体金试剂、上海科华生物工程股份有限公司生产的HBsAg ELISA定性试剂、苏州新波生物技术有限公司生产的HBsAg时间分辨免疫荧光定量试剂、珠海丽珠试剂股份有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原确认试剂、中山大学达安基因工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒DNA试剂。

1．3方法收集血清按试剂盒说明及仪器要求操作，分别检测HBsAg和HBV－DNA。

1.4 统计学分析用SPSS 17.0软件对时间分辨免疫荧光方法分别与胶体金方法和ELISA方法进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三种方法检测结果时间分辨免疫荧光方法检测920例标本阳性112例，阴性808例；ELISA方法检测出阳性104例，阴性816例；胶体金方法检出阳性96例，阴性824例，结果见表1；时间分辨免疫荧光方法分别与ELISA方法和胶体金方法比较，差异有统计学意义（P=0.008、0.00）。

表1 920例体检者HBsAg胶体金方法、ELISA方法与时间分辨免疫荧光方法检测结果

2.2 确认试验经中和确认试验确认，112例标本均确认阳性。见表2。

2.3 实时荧光PCR检测112例阳性标本，HBVDNA阳性78例（69.6%）。见表2。

表2 112例阳性标本中和确认结果与HBV－DNA结果

3 讨论

1971年Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA），这种方法具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，得到迅速发展和广泛应用，是一种经典的免疫检测方法，是目前最常用的一种方法，各文献报道［2］和几十年的使用经验，其敏感性、特异性已落后于现在对检验质量的要求。随着检验技术的不断发展和日新月异，而对于乙型肝炎病毒的检测方法已从ELISA这种定性方法发展到更准确更方便快捷的定量方法，且技术成熟。而ELISA方法耗时较长，因其方法的性质和我国实际情况，ELISA方法检测步骤从快速的一步法再因为避免钩状效应（hook effect）改为现在的二步法，一般要2.5h才能得出结果。另外，从表1结果可知其漏诊率为7.1%，而对于目前医患关系不佳的情况下，检验的发展是更准确更高效。再有，目前新的说法是所有ELISA方法检测结果应报有反应性或无反应性，而不能报阳性或阴性。文献报道免疫静默感染的乙肝也会导致的常规ELISA的漏检［3］。所以，ELISA方法作为常规的乙型肝炎病毒的常规检测方法已不合时宜，而应该选择准确性更高的定量方法。

胶体金方法是快速方法的代表，其成本也比ELISA方法高，胶体金方法其特点是结果快，一般几分钟就可得出结果，从表1数据可知其准确性和漏诊率都不及ELISA方法，与其他报道结论一致［4］。因此，胶体金方法不推荐常规体检和筛查，只适合在POCT或急诊手术前急需结果时使用，但建议最好有其他方法补充检测以免漏检。

乙型肝炎病毒定量检测的方法除了时间分辨免疫荧光方法外，还有化学发光方法等。而时间分辨免疫荧光方法是定量方法中最便宜的，所以本研究采用此方法。从表2的确认结果可以看出时间分辨免疫荧光方法的结果是可靠的。定量方法除了对乙型肝炎病毒肝炎的治疗和疗效评估提供可靠的数据外，还能对乙型肝炎病毒疫苗接种效果评估。不管是日常体检筛查还是乙型肝炎患者的随访复查，定量方法能为临床诊断、疗效评估和免疫接种效果提供准确的数据，而定性的方法在这一方面是达不到这要求的。毫无疑问，定量方法对于诊断和治疗都有显著的临床意义和比ELISA、胶体金等方法的灵敏度和特异性都高，与文献报道结论相同［5］。需要说明的是，当其结果阳性数值在低限时，是否就真的是真阳性，这需要临床医生和检验者的注意或进一步确认，这检测方法虽然是定量，但诊断只能是有或否，在临界值附近不管是定性还是定量都会出现不同的两种结果［6］。且樊璐报道的隐匿性乙肝病毒也不容忽视［7］，所以，日常工作中，对于低含量的阳性标本，最好能建议作确认或跟踪复查为好。

HBV-DNA是反映体内乙型肝炎病毒的复制水平，当体内只是携带乙型肝炎病毒，而病毒本身不活跃或不复制时，其水平是检不出的，从表2数据中可以看出，只36%经确认的标本其HBV-DNA水平是高出检测下限。因此HBV-DNA也只适用于抗病毒治疗或疗效评估的指标。而对于HBVDNA在感染窗口期可检测这一说法，还要进一步分析，因为在窗口期其病毒含量是否达到检测限很难说，在窗口期内是否被机体免疫清除也是未知的。而这样的阐述不是说HBV-DNA检测在窗口其没必要，而是要辨证及发展的看待窗口期HBV-DNA结果。HBV-DNA低于检测下限的标本也不能说明未感染HBV或不携带乙型肝炎病毒，因为如果HBV病毒没有复制时，是检测不出的，也要考虑到PCR方法也有其局限性［8］，田耘博等报道的不同核酸（NAT）检测方法结果也不一致［9］，所以，对于在窗口期诊断，低于检测下限不能排除没感染，必须要随访复查。随着技术的不断发展，新型的PCR检测［10］］也开始应用。

乙型肝炎病毒有多种亚型［11，12］，任何一种试剂都不可能检测全部的亚型。同时也要考虑试剂间的差异，因每一个厂家或品牌试剂所选择的抗体包被物或亚型都有可能不同，不管是什么方法、项目，主要试剂厂家不同，其结果都有可能不一致。而随着科技的不断发展和完善，对于乙型肝炎的治疗和检测项目也会发展更多项目或方法，如现在的超敏HBV-DNA［13］，将更好为乙型肝炎的治疗提供更方便更优质的检验项目或方法。对一些少见类型的乙型肝炎病毒、二对半结果组合少见尤其是病毒含量低，或感染早期（窗口期）、免疫清除过程等原因的特殊例子已有文献的相关报道［14，15］。

乙型肝炎病毒相关检测还有前S1抗原，与乙型肝炎病毒的传染性和病毒复制有关［16］，这一指标是感染乙型肝炎病毒最早出现，但消失也快，因此在清除病毒过程中检测前S1抗原更优于HBsAg。而对于基因分型主要应用于乙型肝炎的耐药治疗，而传统的突变位点向日渐成熟的表型耐药检测并发挥更加广泛的作用［17］。

综上所述，随着科学技术的日新月异，乙型肝炎病毒标志物的检验方法应与时俱进。为了更好的在乙型肝炎的诊断、治疗等方面特别是早发现早治疗方面考虑，减少漏诊率和避免医疗纠纷，应尽早由准确性更高的定量方法替代目前常用ELISA方法。

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The selection and application of detection method of hepatitis B virus markers

LIAN Jinming，CHEN Cong，OU Zhilian，CHEN Kangrong，LIANG huiming，TANG Jiayu.

Central People's Hospital of Zhanjiang，Guangdong Zhanjiang 524037，China.

Objective To investigate the application value and reasonable choice of the qualitative and quantitative methods in clinical diagnosis and treatment of HBV.Methods The research was collected 920 cases of health check-up，detected the HBsAg with colloidal gold，ELISA and TR-FIA method，then the positive samples retested by neutralization confirmatory and tested HBVDNA by PCR.Results The colloidal gold method detected positive 96 cases，the ELISA method were positive 104 cases and the TR-FIA method were positive 112 in the 920 cases.Differences had statistical significance by TR-FIV with colloidal and ELISA methods（P＜0.001，P=0.008）.Conclusions The routine detection method of hepatitis B virus markers should be replaced by the high accuracy of quantitative methods.

HBV Detection method Colloidal gold ELISA TR-FIA PCR

R446.62，R512.6+2

A

1674-1129（2016）05-0568-03

10.3969/j.issn.1674-1129.2016.05.010

2016-05-13；

2016-07-09）

湛江市科技攻关项目（编号：2014B01109）

梁金明，男，1974年2月生，主任技师，医学检验专业，主要从事免疫学检验及分子诊断。邮箱：13828252013@139.com