不同种源的三叶木通ITS序列分析及亲缘关系*

周文才，左继林，占志勇，王玉娟，幸伟年，龚春

(江西省林业科学院，江西　南昌330013)



不同种源的三叶木通ITS序列分析及亲缘关系*

周文才，左继林，占志勇，王玉娟，幸伟年，龚春

(江西省林业科学院，江西南昌330013)

对9份不同种源三叶木通样本的核糖体DNA ITS区序列进行测定与分析，同时分析遗传距离并构建NJ树。结果表明，参试的9份三叶木通样本的ITS区序列全长均为653bp，其中ITSl序列长度为269bp，ITS2序列长度为221bp；整个ITS序列区共有7个(1.07%)变异位点，其中ITS1、5.8S和ITS2的变异位点分别为4、0和3个，这些变异位点可作为三叶木通不同种源鉴别的信息位点；各序列间的遗传分化距离为0.002～0.008，聚类结果9个样本构成2个分支，并显示出三叶木通的亲缘关系与其地理分布有一定关系。

三叶木通；ITS；亲缘关系；种源

三叶木通(Akebiatrifoliata)为木通科(Lardizabalaceae)木通属(Akebia)落叶木质藤本，在中国黄河流域以南各省(区)都有分布[1]。三叶木通为中国传统的中药材，其根、藤茎、果实等具有通筋活络、解毒、消炎等功效[2]，其果实为肉质蓇葖果，色香味俱全，是珍稀的绿色水果和保健食品。此外，三叶木通的茎蔓柔软多姿，具有较好的观赏价值，因此三叶木通是极具开发价值的野生植物资源。

当前国内外对三叶木通的研究还处于起步阶段，主要集中在生物性状观测[3～4]、育苗繁殖培育[5～6]、成分分析[7～8]等方面，而对三叶木通的资源评价方面研究很少。李秀华等[9]曾对73份三叶木通种质资源进行了表型研究，结果显示三叶木通存在丰富的形态学变异，其中果实的各指标变异幅度最大。到目前为止，在分子水平对三叶木通种质资源评价还未见报道。

核糖体DNA内部转录间隔区又叫ITS(internal transcribed spacer)序列，由ITSl、5.8S和ITS2 3个部分组成。ITS序列分析技术因其技术简单、稳定性好等优点，近年来已被广泛用于植物种内变异及近缘植物属间、种间的分子系统发育学等研究[10～12]。为此本文通过测定三叶木通9个种源材料rDNA的ITS序列并进行比较分析，旨在从分子水平探讨不同种源三叶木通的种内变异情况及其亲缘关系。

1　材料和方法

1.1材料

采集三叶木通新鲜叶片，酒精表面消毒后置于硅胶中干燥保存，用于DNA提取，具体材料及来源见表1。

表1　9个三叶木通样本的采集信息Tab.1　The gathering information of 9 samples of Akebia trifoliata

1.2DNA的提取

称取约0.5g干燥三叶木通叶片，加入液氮进行研磨，直至成粉末，DNA提取采用SDS-CTAB法操作[13]。

1.3ITS序列的扩增及测序

用于扩增ITS序列的引物参照Kitaoka等[14]实验，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，其中上游引物为Akebi-F(5'-GCTCCTACCGATTGAATGGT -3')，下游引物为Ake-26SR(5'-GTAAGTTTCTTCTCCTCCGC-3')。PCR扩增反应于Gen AMP 9700扩增仪上进行，扩增反应体系为25μL，其中0.2μL Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)、2.5μL 10×Buffer、2.0μL dNTP(含Mg2+2.5 pmol/μL)，2μL模板DNA(20ng/μL)，上下游引物各1μL(10μmol/L)，最后加ddH2O 定容至25μL。PCR反应程序为，94℃预变性4min；94℃变性1min，55℃退火30s,72℃延伸1min,共计30个循环；最后延伸72℃ 5min；4℃保存。

PCR扩增产物经纯化后，为保证测序质量，根据上下引物以ABI 3730 DNA测序仪进行双向测序，然后根据测序结果拼接出完整序列。PCR产物纯化、序列测定和拼接工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4ITS序列分析

根据Gen Bank中木通的ITS序列范围确定rDNA内转录区ITSl、5.8S及 ITS2的界限，获得ITS全长序列，将所得序列利用DNAMAN v6.0软件进行比对，并辅以人工校对，利用MEGA v5.1软件计算遗传距离及构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1三叶木通ITS序列的长度及变异

获得测序数据后，根据Gen Bank中三叶木通的ITS序列范围(Gen Bank登录号为FJ868728)，确定三叶木通rDNA内转录区ITSl、5.8S和ITS2序列，最终得到ITS全长序列。测得9个样本ITSl、5.8S rDNA和ITS2序列全长均为653bp，其中ITSl序列长度为269bp，5.8S rDNA序列长度为163bp，ITS2序列长度为221bp，ITS各区间长度的一致性表明ITS序列长度保守性很高。整个ITS序列区一共有7个碱基位点发生了变异(表2)，占了总序列的1.07%。此外ITS变异位点稳定，其碱基的变异类型分别是第132位碱基的“T”变为“G”、第133位碱基的“G”变为“A”、第222位碱基的“G”变为“A”、第227位碱基的“C”变为“A”、第533位碱基的“G”变为“A”、第565位碱基的“T”变为“C”、 第591位碱基的“T”变为“C”，这些位点可作为不同种质材料DNA指纹鉴别的信息位点。

表2　三叶木通ITS序列变异位点Tab.2　The variable sites in the whole ITS sequence of Akebia trifoliata

分析发现三叶木通样品中ITS各区段序列发生变异的位点数不同，其中ITSl变异位点为4个，占其总位点数的1.49%；ITS2序列变异位点有3个，占其总位点数的1.36%；而5.8S序列位点非常稳定，没有变异位点。

2.2不同种源三叶木通遗传距离及系统树构建

利用MEGA v5.1软件，以Kimura-2参数分析不同产地三叶木通的遗传距离(见表3)。得到样品间的遗传距离介于0.002～0.008之间，表明三叶木通各个样本之间ITS区存在遗传变异，但变异率较低，其中鹤城区样本和武宁、玉山、宁国样本间的遗传距离最大。

基于遗传距离对9个三叶木通样本构建了系统发育树，结果见图1。9个样本可分为两支，其中玉山、宁国、武宁、景德镇、浮梁样本聚在一起组成了一个分支；另一个分支上，鹤峰县和鹤城区样本先聚在一起，然后依次与凯里、南昌样本聚在一起组成分支。以上聚类结果表明不同种源三叶木通的亲缘关系与其地理分布有一定的关系。

表3　ITS基因序列之间的遗传分化距离Tab.3　The genetic differentiation distance of ITS spacers

图1　基于ITS序列构建的系统发育树Fig.1　Phylogenetic tree based on ITS sequence

3　结论与讨论

ITS序列的进化速率较快，物种间变异丰富，因此非常适用于种间及近缘属间等物种的鉴定及系统发育研究，而在种内变异分析方面，不同的物种中其应用价值不同。如在一些物种内ITS不存在位点多态性[15～16]，而在一些物种中ITS存在较丰富的变异，并可用于物种的种内不同居群的分子鉴定及亲缘关系研究。如严寒静等[17]对不同种源何首乌(Fallopiamultiflor)的ITS 区序列进行测定分析，结果支持将田阳何首乌作为何首乌的一个变种—棱枝何首乌。王洁等[18]对不同产区厚朴(Magnoliaofficinalis)的ITS 序列分析及亲缘关系鉴定，表明ITS的位点变异与厚朴部分叶形变化有吻合，但无必然联系。易骏等[19]研究了不同产地孩儿参(Pseudostellariaheterophylla)的ITS序列差异，为孩儿参的道地性鉴别提供了鉴别依据。本文通过测定并比较三叶木通的ITS序列，发现9个样本ITS序列全长均为653bp，其中ITSl序列长度269bp，5.8S rDNA序列长度163bp，ITS2序列长度221bp，ITS序列长度表现出高度的保守性。分析发现各样本间的碱基差异不大，这种较小的差异性也反映了其遗传的稳定性。其中，ITS1和ITS2序列变异位点共有7个，其变异类型有4种(包括T-G、A-G、A-C、T-C)，这些差异的位点可以作为不同种源三叶木通的识别特征，这也说明ITS序列对于不同种源的三叶木通种质鉴定研究具有一定指导意义。此外，5.8S rDNA的长度都为163bp，这和前人研究被子植物rDNA ITS区中5.8S序列长度非常保守的结果一致[20]。

根据遗传距离进行聚类分析，可以直观地了解不同种源样品间的亲缘关系。本文利用三叶木通的ITS序列进行聚类分析，结果显示来自赣东北地区的样本和来自安徽宁国的样本聚在了一起，而来自凯里和鹤城区等地样本聚在一支，表明三叶木通的亲缘关系与其地理分布有一定相关性，也反映了三叶木通的ITS序列差异性与其地理分布有一定相关性。

在开展植物物种鉴定时，Chase等[21]研究显示ITS2序列与ITS全长序列的物种鉴定效率相当，而ITS2序列长度只有ITS序列的三分之一，因此认为ITS2序列具有较高的扩增效率。Chen等[22]也提出利用ITS2序列鉴定药用植物品种。本实验结果显示三叶木通种内ITS变异位点一共只有7个，其中ITS1变异位点4个，ITS2变异位点3个，如果仅仅根据ITS中的部分序列将很难对不同种源的样本进行全面分析，因此在利用ITS序列开展植物种内变异及亲缘关系分析时，应根据材料ITS序列变异具体情况选择合适的序列区间。

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ITS Sequences Analysis and Genetic Relationship of Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.from Different Provenances

ZHOU Wen-cai，ZUO Ji-lin，ZHAN Zhi-yong，WANG Yu-juan，XING Wei-nian，GONG Chun

(Jiangxi Academy of Forestry,Nanchang Jiangxi 330013,P.R.China)

The rDNA ITS base sequences were measured and analyzed from 9 materials ofAkebiatrifoliata(Thunb.) Koidz., and genetic distance was analyzed and Neighbor-joining (NJ) tree was built. The results showed that the sequence length of each ITS of these 9 materials were 653 bp, and among which, that of ITS1 was 269 bp, and that of ITS2 was 221 bp.There were 7 variable sites (1.07%) in the whole ITS sequence.There were 4, 0, and 3 mutation sites in ITS1, 5.8S and ITS2, respectively, and these variable sites could be used as the informative sites for provenance identification. The genetic differentiation distance between sequences ranged from 0.002 to 0.008. The 9 materials can be classified as 2 clades according to their cluster dendrogram, which indicated the genetic relationship ofAkebiatrifoliata(Thunb.) Koidz. have certain relations to their geographical distribution.

Akebiatrifoliata(Thunb.) Koidz.; ITS; genetic relationship; prowenances

10.16473/j.cnki.xblykx1972.2016.05.010

2015-11-24

国家林业局2013年林业公益性行业科研专项“木通科特色蓇葖果良种选育及高效栽培技术研究”(201304802)。

周文才(1978-)，男，助理研究员，博士，主要从事林木遗传育种、经济林研究工作。

E-mail：zhouwencai2000@163.com

简介：龚春(1975-)，女，研究员，硕士，主要从事经济林研究与开发利用工作。E-mail：gclhy@263.net

S 567;Q 943.2

A

1672-8246(2016)05-0054-04