酶联免疫吸附法（ELISA）检测鸡肉中氯霉素

薛金英

（山东省诸城市畜牧兽医管理局山东潍坊262200）

酶联免疫吸附法（ELISA）检测鸡肉中氯霉素

薛金英

（山东省诸城市畜牧兽医管理局山东潍坊262200）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是一种广谱抗生素。具有良好的抗菌效果且价格低廉，广泛应用于家禽的各种传染性疾病的治疗。但是氯霉素对造血系统有严重不良反应，主要是抑制骨髓造血机能。因此，找到一种快速、简便而又准确的检测方法成为了业界十分关注的课题。传统上常用HPLC与TLC来作为抗生素检测的方法，但效率低、灵敏度也达不到要求。酶联免疫吸附法经笔者实践证明，操作简便、试验过程短、检测样品多，特异性高，且检测灵敏度最低可达0.01μg/L。

ELISA；鸡肉；氯霉素

1　试验原理

采用直接竞争ELISA法检测样品中的氯霉素。包被抗原与加入的标准品或待测样品竞争抗体，加入酶标记物，酶标记物与抗体结合。通过洗涤除去游离的抗原、抗体及抗原抗体复合物。加入底物液，使结合到板上酶标记物将底物转化为有色产物。加入终止液，在450 nm处测定吸光度值与试样中氯霉素的自然对数成反比。

2　实验仪器材料

1）仪器耗材:微孔板酶标仪（450 nm）、电子天平、振荡器、均质机、离心机、氮吹仪、离心管和玻璃试管、可调式5 μL～50 μL、20 μL～200 μL和100 μL～1000 μL微量移液器、拍板纸。

2）试剂：乙酸乙酯（分析纯）、正己烷（分析纯）、去离子水或蒸馏水。

3）检测试剂盒组成：包有氯霉素抗体的微孔板、氯霉素标准品溶液（0号：0μg/L；1号：0.02μg/L；2号：0.06μg/L；3号：0.18μg/L；4号：0.36μg/L；5号：0.72μg/L）、20×浓缩洗涤液、10×浓缩样品复溶液、5×氯霉素标记HRP溶液、底物A溶液、底物B溶液、终止液、封板膜。

3　样品提取（稀释倍数为0.5倍）

现配1×样品复溶液：10×浓缩样品复溶液用蒸馏水稀释10倍后使用。（如1 mL10×浓缩样品复溶液加9 mL蒸馏水稀释）。

1）称取3 g已均质的鸡肉放入50 mL离心管中，加入4 mL1×样品复溶液（现用现配：10×浓缩样品复溶液用蒸馏水稀释10倍后使用，如1 mL10×浓缩样品复溶液加9 mL蒸馏水稀释），再加入6 mL乙酸乙酯，剧烈震荡5 min；

2）室温3 000 g离心5 min，取4 mL上层液（乙酸乙酯）至10 mL玻璃试管中，于50℃下，氮气将有机相吹干；

3）于此玻璃试管中加入正己烷2 mL，先将残余物完全溶解后，再加入1 mL 1×样品复溶液，震荡30 s；

4）以3 000 g离心5 min，吸去包含中间乳化层的上层液（正己烷），再吸取下层液（水层）备用。

4　检测步骤

1）从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温（20～25℃）平衡30 min以上，注意每种试剂使用前均需摇匀。

2）1×氯霉素标记HRP溶液的配制（现配现用）：将5×氯霉素标记HRP溶液与1×样品复溶液按照体积比1∶4混合均匀待用。

3）编号：将样品和标准品对应微孔按序编号，每个样品和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4）加样：加入标准品和处理好的试样各100 μL到各自的微孔中，然后加入1×氯霉素标记HRP溶液50 μL到每个微孔中。

5）温育：用盖板膜盖板，轻轻振荡混匀，置于室温环境中反应15～20 min。

6）洗涤：取出酶标板，将孔内液体甩干，每孔加入1×洗涤液250 μ到每个板孔中，洗板3次，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头戳破）。

7）显色：加入底物液A液50 μL，再加入底物液B液50 μL到微孔中，轻轻振荡混匀，室温环境中避光显色15～20 min。

8）测定：加入终止液50 μL到微孔中，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450 nm处，测定每孔吸光度值。

5　结果判定

1）按公式计算：

式中：B：标准溶液或样品的平均吸光度值；B0：0浓度的标准溶液的平均吸光度值。

2）将计算的相对吸光度值对应氯霉素的自然对数作半对数坐标系统曲线图，对应的试样浓度可从校正曲线算出，公式如下：

式中X:试样中氯霉素含量，单位为μg/kg；A:试样的相对吸光度值对应的氯霉素含量，单位为μg/L；F:试样的稀释倍数；M:试样的取样量，单位为g。计算结果保留小数后两位。

6　结论

本试验样品最低检测限为0.01 μg/kg，回收率一般在80%～110%之间，为确保结果准确，试验过程中应注意以下问题：

试剂盒应冷藏保存，开封后的试剂盒应尽快使用，试验前，提前将样品及所需试剂从冰箱中拿出，平衡至室温，以防检测吸光度值偏低。试剂盒开封后3个月内用完。若样品的百分比吸光值（%）超出标准曲线范围，应使用1×样品复溶液做适当稀释后测定。氯霉素标准溶液含氯霉素，请小心操作。不要使用过期的试剂盒，不同批号试剂不能混用。■（编辑:赵晓松）

Detection of Chloramphenicol in Chicken by ELISA

Xue Jinying
（Shandong Province Zhucheng Animal Husbandry and VeterAdministration，WeiFang ShanDong，262200）

Chloramphenicol（CAP）is a broad-spectrum antibiotic.Has a good antibacterial effect and low price，is widely used in poultry of various infectious diseases.However，chloramphenicol on hematopoietic system has serious adverse reactions，mainly to inhibit bone marrow hematopoietic function.Therefore，finding a fast，simple and accurate detection method has become a topic of great concern in food analysis field in recent years.Traditionally，HPLC and TLC have been used as the method of antibiotic detection，but the efficiency is low and the sensitivity is not up to the requirement.Enzyme-linked immunosorbent assay proved by the author，easy to operate，the test process is short，multi-sample detection，high specificity，and the detection sensitivity of up to 0.01μg/L.

ELISA；Chicken；Chloramphenicol.

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.10.043