液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中6种极性农药残留量*

郭平，万建春，祝建新，占春瑞，左海根

（江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，南昌 330038）

液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中6种极性农药残留量*

郭平，万建春，祝建新，占春瑞，左海根

（江西出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，南昌 330038）

建立了百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺6种极性农药的液相色谱-串联质谱测定方法。采用SCX和C18复合填料（质量比为1∶20）的Shiseido CAPCELL PAK CR色谱柱分离，用超高压液相色谱-串联质谱仪测定。利用响应面法优化得到样品的前处理条件，蔬菜样品用甲酸-乙腈溶液均质提取，三氯甲烷液-液萃取净化，在定量限的1，2，10倍浓度水平，回收率在61.7%～116.8%之间，测定结果的相对标准偏差不大于13.6%（n=6）。该法适用于蔬菜中百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺残留量的测定。

百草枯；敌草快；矮壮素；缩节胺；单甲脒；灭蝇胺；蔬菜；残留量；液相色谱-串联质谱法

百草枯（paraquat，PQ）、敌草快（diquat，DQ）、矮壮素（chlormequat，CQ）、缩节胺（mepiquat，MQ）都是常见的季铵盐类农药，它们易溶于水、挥发性低、在酸性和中性条件下化学性质稳定［1］；单甲脒（semiamitraz，ST）和灭蝇胺（cyromazine，CZ）是强碱性极性阳离子有机化物，易溶于水等极性溶剂。

百草枯是用量仅次于草甘膦的全球第二大除草剂［2］。百草枯毒性很强，目前临床缺少有效的治疗手段，百草枯中毒致死率非常高［3-4］。我国国家标准GB 2763-2014中规定了多种蔬菜品种中百草枯限量要求，目前蔬菜中百草枯残留量的检测标准方法是紫外分光光度法［5］，该法专属性不强，易受基质干扰，而且操作步骤复杂。液质联用技术具有高灵敏度和专属性强等特点，在复杂基质样品农药残留分析中具有独特的优势。目前有较多研究者采用液质联用技术测定食品中农药残留［6-11］，而对百草枯等强极性农药更多的是采用离子对试剂或用亲水色谱柱进行色谱分离。离子对试剂的使用会影响质谱的灵敏度［12］，而亲水色谱柱则需要高浓度的缓冲盐，这同样会影响质谱的灵敏度。笔者采用SCX和C18复合固定相的反相色谱柱分离后进行质谱分析，建立了蔬菜中极性农药残留量的快速测定方法。

1　实验部分

1.1主要仪器与试剂

液质联用仪：TSQ-Quantiva 型，配ESI离子源，美国塞默飞世尔科技有限公司；

高速组织匀浆机：IKA-T25型，德国IKA公司；

超纯水机：Milli-Q型，美国Millipore公司；

涡旋混匀器：Vortex-Genie2型，美国Scientific Industries公司；

常速离心机：TDL-5-A型，上海安亭公司；

高速离心机：5430R型，德国Eppendorf公司；

百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺标准物质：德国Dr. Ehrenstorfer公司；

乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

甲酸：色谱纯，美国Sigma公司；

三氯甲烷、乙酸铵：色谱纯，上海安谱公司；

实验用水为超纯水（Milli-Q超纯水机制得）。

1.2溶液的配制

百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺标准溶液：分别准确称取10 mg标准品于10 mL容量瓶中，用水溶解并定容，制得1.0 mg/mL标准储备液，于-18℃下储藏。标准中间液用水稀释储备液至适当浓度备用。

甲酸-乙腈提取液：分别量取50 mL甲酸，加入250 mL乙腈，加水溶解并定容至1 000 mL，现配现用。

1.3仪器工作条件

1.3.1色谱条件

色谱柱：Shiseido CAPCELL PAK CR柱（150 mm×2.1 mm，3.5 µm）；柱温：30℃；流动相：A为5 mmol/L乙酸铵溶液（含0.1%甲酸），B为99%乙腈溶液（含5 mmol/L乙酸铵）；流动相流量：0.3 mL/min；进样体积：5 µL；梯度洗脱程序见表1。

表1　梯度洗脱程序

1.3.2质谱条件

正模式扫描；选择反应监测（SRM）；毛细管电压：3 500 V；雾化气压力：276 kPa（40 psi）；鞘气压力：103 kPa（15 psi）；反吹气压力：138 kPa（20 psi）；离子传输管温度：350℃；雾化气温度：400℃。6种农药的其它质谱参数见表2。

表2　6种农药的质谱参数

1.4样品前处理

称取试样10.0 g至50 mL聚丙烯离心管内，加入10 mL甲酸-乙腈提取液，高速匀浆提取1 min，加入10 mL三氯甲烷，以4 500 r/min离心5 min，上层清液全部转移至25 mL比色管中，残渣中再加入10 mL甲酸-乙腈提取液，涡旋提取30 s后，以4 500 r/min离心5 min，合并上层清液至25 mL比色管中，用甲酸-乙腈提取液定容至标线，混合均匀，取1 mL甲酸-乙腈提取液至1.5 mL离心管中，以15 000 r/min离心5 min，上层清液过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定。

2　结果与讨论

2.1质谱条件的优化

百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺都是季铵盐类化合物，属强极性化合物，而单甲脒、灭蝇胺结构中也含有氨基结构，在质谱离子化时，形成正离子。在质谱优化时，由针泵注入1.0 μg/mL的标准溶液，为提高方法的优化效果，设定0.3 mL/min 的流量，等比例注入流动相A和流动相B，调节质谱源参数，在一级母离子扫描方式下使化合物的母离子响应值达到最高。在子离子扫描方式下，设置碰撞气为0.2 Pa，通过调节不同碰撞能量，得到较为理想的碎片离子信息，再利用仪器的自动优化功能，优化离子对最佳碰撞能量和透镜电压。

2.2色谱条件的优化

季铵盐类化合物分子极性较强，在反相色谱柱中难有保留，通常加入七氟丁酸、庚烷磺酸钠等离子对试剂，以改善其在反相色谱柱上的色谱行为，但离子对试剂会造成质谱灵敏度降低。选择CAPCELL PAK CR色谱柱，其固定相由SCX和反相C18填料组成，为避免季铵盐类化合物的死吸附，选择SCX和C18填料为1∶20的CR柱。乙酸铵缓冲溶液适合于质谱分析，铵盐也可洗脱阳离子化合物，实验采用含5 mmol/L乙酸铵溶液的流动相，并优化了梯度洗脱条件。实验发现流动相含有一定比例的有机相，可改善矮壮素的色谱峰形，而含有乙酸铵，可保证其它化合物充分洗脱。实验用空白蔬菜添加6种农药，按1.4步骤操作，得到空白蔬菜加标试样溶液，加标试样溶液在1.3仪器工作条件下测定，色谱图见图1。由图1可知，6种农药分离较理想，色谱峰形非常尖锐，目标物出峰位置没有干扰峰。

图1　空白蔬菜添加6种农药混合标准溶液的色谱图

2.3样品前处理条件的优化

百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺都是极性化合物，呈碱性，易溶于水，目前多采用酸性提取液提取，因蔬菜含色素较多，故采用甲酸溶液均质提取，加入乙腈沉淀纤维，用三氯甲烷除去色素。6种农药的碱性强弱和极性差异有所不同，甲酸溶液的浓度和乙腈的加入量可能影响各目标物的提取效率。以各化合物回收率为响应值，对甲酸溶液的浓度和乙腈-水比例进行2因素5水平响应面中心组合试验，发现甲酸溶液的浓度和乙腈用量对提取效率均有影响，矮壮素随甲酸溶液浓度的升高回收率升高明显，单甲脒、灭蝇胺、缩节胺随着乙腈用量的增加回收率下降明显，可能是这些化合物极性相对偏弱，有部分溶解在有机相中所致。百草枯和敌草快回收率偏低，乙腈用量和甲酸溶液浓度的大小对其回收率影响不明显，但不含甲酸的提取液相比含甲酸的提取液回收率明显偏低，因此最终确定采用含5%甲酸-乙腈水溶液（体积比为25∶75）为提取溶液。

2.4线性方程和检出限

用阴性蔬菜样品进行加标试验，以待测物的信噪比（S/N）为10确定方法的定量限。质谱法测定时，基质效应难以避免，而百草枯和敌草快的绝对回收率偏低，本方法确定采用基质添加匹配标准工作曲线进行定量。6种农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限见表3。

表3　各化合物在蔬菜样品中的检出限、定量限、线性方程1）

2.5加标回收试验

采用阴性蔬菜样品，分别在1，2，10倍定量限水平进行加标回收试验，结果见表4。由表4可知，6种农药加标回收率在61.7%～116.8%之间，测定结果的相对标准偏差不大于13.6%，精密度和准确度满足分析要求。

表4　蔬菜中6种农药添加回收试验结果

3　结语

建立蔬菜中百草枯、敌草快、矮壮素、缩节胺、单甲脒、灭蝇胺残留量的测定方法，使用阳离子交换和反相填料的色谱柱进行分离，对季铵盐类农药有较理想的保留作用。该方法采用甲酸-乙腈水溶液提取，以三氯甲烷除去色素，对季铵盐类农药提取效率高，灵敏度高，稳定性好，操作简便。研究过程中发现，百草枯和敌草快在蔬菜样品中绝对回收率偏低，有研究表明百草枯在土壤中极易被钝化［13］，这或许是百草枯和敌草快受到样品中金属离子的影响，而导致绝对回收率偏低的原因，这一现象还有待进一步研究。

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Determination of Six Kinds of Polar Pesticide Residue in Vegetables by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

Guo Ping， Wan Jianchun， Zhu Jianxin， Zhan Chunrui， Zuo Haigen
（Comprehensive Technology Center of Jiangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Nanchang 330038， China）

A HPLC-MS/MS method was established for determination of polar pesticides residues of paraquat，diquat， chlormequat， mepiquat， semiamitraz， cyromazine. The chromatographic separation was achieved by ultra high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry， using a CAPCELL PAK CR column with SCX and C18mixing proportion of 1∶20. The sample pretreatment conditions was optimized by response surface method， vegetable samples were extracted with formic acid-acetonitrile solution， and purified by liquid-liquid extraction with chloroform. The recoveries were 61.7%-116.8% with the relative standard deviation not more than 13.6%（n=6） in the level of 1， 2， 10 times concentration of the limit quantification （LOQ）. The method is suitable for the determination of paraquat， diquat，chlormequat， mepiquat， semiamitraz， cyromazine residues in vegitables.

paraquat； diquat； chlormequat； mepiquat； semiamitraz； cyromazine； vegetable； residue； LC-MS/MS

O657.63

A

1008-6145（2016）02-0023-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.02.007

*江西省科技厅科研项目（20141BBG70096）

联系人：万建春；E-mail： wojiaoandy@aliyun.com

2015-12-04