HPLC法测定酵母菌细胞内维生素B1含量

尹　鹏，于　倩*，李　忻，孙　岩，陈　雪，王恩鹏

(1.吉林大学中日联谊医院，长春 130033；2.长春中医药大学，长春 130117)



HPLC法测定酵母菌细胞内维生素B1含量

尹鹏1，于倩1*，李忻1，孙岩2，陈雪2，王恩鹏2

(1.吉林大学中日联谊医院，长春 130033；2.长春中医药大学，长春 130117)

目的建立酵母菌细胞内维生素B1的含量测定方法。方法采用Thermo DBS-C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为水-甲醇(70∶30)，流速1.2 mL/min，柱温35 ℃，检测波长为238 nm。结果维生素B1在浓度1.0～5.0 μg/mL浓度范围内线性关系良好(Y=294 400.5X-65 837.9，r=0.997 9)，方法回收率为88%～92%，重现性在RSD=0.8%～1.24%(n=5)。结论本测定方法准确、可靠，重复性好，可用于测定酵母菌细胞内维生素B1含量。

酵母菌；维生素B1；HPLC

酵母是一种可食用的、营养丰富的单细胞微生物，含有较多的蛋白质(占细胞干重的40%～60%)，消化吸收率很高，酵母蛋白质中富含人体必需的8种氨基酸，特别是谷物中含量较少的赖氨酸含量较高[1-3]。酵母中氨基酸的组成比例接近联合国粮农组织(FAO)推荐的理想氨基酸组成，由于酵母菌体中富含维生素B1,其含量高于某些蔬菜、水果、鸡蛋、鱼、肉，且含有海藻糖、辅酶A等特殊疗效物质，而近年来新兴开发的一些食用酵母可在人体内很快被吸收与利用，所以研究酵母菌体内维生素B1有很大的经济价值与应用前景[4-6]。维生素 B1的测定方法已有很多报道,如荧光目测法、荧光计法、紫外分光光度法及偶氮染料比色法等，然而这些方法大多数耗费时间长，操作繁琐，不确定因素较多[7-9]。因此本文采用HPLC法对酵母菌细胞内维生素B1含量进行测定，为研究酵母菌体内维生素B1含量测定方法提供了依据。

1　实验材料

菌种实验采用了酵母TY-3，本实验室保存菌种。试剂维生素B1对照品，购于中国生物制品检定所。蛋白胨(天津市化学试剂批发厂)，麦芽浸膏(北京奥博星生物技术有限公司)，处理琼脂(北京化学试剂公司)，甲醇为色谱纯(天津永大生物技术中心)，其他试剂为分析纯(北京化工厂)。离心机LD5-2A(北京医用离心机厂)，DL102型电热鼓风干燥箱(天津市试验仪器厂)，生化培养箱(生化培养箱)，电子天平JA12002(上海精科仪器厂)，SPD-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司)，TDA-8002型水浴锅(天津中环实验电炉有限公司)，TGL16 g高速台式离心机(上海医用分析仪器厂)，培养基为种子培养基(YEPD)、固体种子培养基，酵母固体基本培养基与文献报道[10]一致。

2　实验方法

2.1菌体培养150 mL三角瓶装有50 mL种子培养基2.1.5(1)接斜面种子1-2环，30 ℃静置培养24 h，作为1级种子液。然后在500 mL三角瓶中装入100 mL YEPD，以10%的接种量接入1级种子液，30 ℃，150 r/min，振荡培养。后离心(3 000 r/min，10 min)并用无菌水洗涤2次，收集菌体备用。2.2色谱条件色谱柱：Thermo DBS-C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：水-甲醇(70∶30)，流速1.2 mL/min，柱温35 ℃，检测波长：238 nm。

2.3供试品溶液的制备准确称取一定量酵母，加入0.1 mol/L HCl溶液，振荡摇匀。121 ℃加热30 min，3 000 r/min离心10 min后洗涤，取上清液，0.22 μm滤膜过滤，备用，参照食品中硫胺素(VB1)的测定，GB/T5009.84-2003。

2.4对照品标准溶液的制备精确称取0.01 g维生素B1标准品，先分别用少量三蒸水配制的0.01 mol盐酸溶解，再分别定容至100 mL棕色容量瓶中，制成浓度为0.1 mg/mL的溶液。精确量取适量上述溶液，再分别稀释制成0.001、0.002、0.003、0.004、0.005 mg/mL的维生素B1标准溶液。

2.5加标回收率实验样品制备取2个25 mL棕色容量瓶，分别移入相同体积的0.001 mg/mL维生素B1标准溶液和作为空白对照的甲醇，并用酵母提取液稀释至刻度，摇匀，经高效液相色谱检测3次后计算其平均回收率。3次回收率实验中选择加入的0.001 mg/mL维生素B1标准溶液体积分别为5.0、7.5、10.0 mL(即2、3、4 μg/mL)。

2.6标准曲线的绘制分别取2.4项下不同浓度1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μg/mL的对照品溶液各10 μL注入色谱仪测定，以维生素B1浓度为横坐标(X)，以峰面积值为纵坐标(Y)绘制标准曲线。

2.7加样回收率试验分别以3种不同的提取液和不同的添加量进行了3次实验，不同的提取液浓度分别为1.32、1.45、1.27 μg/mL为基底，对应添加量为2、3、4 μg/mL的维生素B1对照品溶液，依照含量测定方法测定加样回收率。

2.8重现性考察取酵母菌体，按2.3供试品溶液的制备项下方法操作，制备3种不同浓度的酵母提取液，分别重复进样5次，考察其重现性。

3　结果

3.1液相条件的确定对不同的流动相进行了大量实验，发现以甲醇和水的组合流动相效果相对较好，通过进一步实验确定甲醇和水最优配比为V甲醇∶V水=30∶70，并确定流速1.0 mL/min。

3.2标准工作曲线按2.6项下方法操作，以浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标作图，得1条近似过原点的直线，回归方程为Y=294 400.5X-65 837.9，r=0.999 5，表明维生素B1的标准品在浓度1.0～5.0 μg/mL之间，进样量与峰面积值呈良好的线性关系。

3.3回收率试验按照2.7项下方法操作测定回收率，得出3次实验的加样回收率范围在(88.7%～92%)，结果见表1，与文献报道[11]结果一致，说明本方法的测定结果准确可靠。

表1　维生素B1提取液中添加不同量维生素B1的回收率

3.4重现性实验按照2.8项下方法操作，其重现性结果范围在RSD=0.8%～1.24%，表明维生素B1的含量以本法测定维生素B1含量的重复性良好。

4　小结

本实验在分离度上、精密度以及重现性上都有着较好的表征，测定酵母菌体内维生素B1含量的方法是否准确、快捷必将对后面实验结果的可靠性、准确性带来直接的影响。因此研究快速准确的维生素B1检测技术是十分必要的。目前用于检测提取液维生素B1含量的方法主要有分光光度法和高效液相色谱法。分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来测定其含量的一项技术，虽然设备、操作简单，但受所测溶液体系内其他成分的影响比较明显，测定结果误差较大。高效液相色谱法其在适用范围、分析速度、分离效能、检测灵敏度和操作自动化方面都达到了分光光度计无法企及的程度。为测定酵母菌细胞内维生素B1含量提供了重要依据。

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[11]朱明华.仪器分析[M].4版.北京:高等教育出版社,2008.

Determination of vitamin B1in yeast cells by HPLC

YIN Peng1,YU Qian1*,LI Xin1,SUN Yan2,CHEN Xue2,WANG Enpeng2

(1.China-Japan Union Hospital of Jilin University,Changchun 130033,China;2.Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China)

ObjectiveTo establish the determination method of vitamin B1in yeast cells.MethodsThe analytical column was Thermo DBS-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)with a mobile phase consisting of water methanol (70∶30) as mobile phase at a flow rate of l.2mL/min,the column temperature was 35 ℃ and UV detection was set at 238 nm.ResultsThe linear range of thiamine was 1.0-5.0 μg/mL (Y=294 400.5X-65 837.9,r= 0.997 9),the method recovery rate rang was 88%-92% with RSD of 0.8%-1.24%(n=5).ConclusionThe method is accurate,reliable and repeatable which can be used to detect vitamin B1in yeast cells.

yeast;Vitamin B1;HPLC

10.13463/j.cnki.cczyy.2016.05.012

吉林省教育厅项目(20150344)；长春市科技局重大科技攻关项目(14KG057)。

尹鹏(1987-)，男，大学本科，药师，主要从事医院药学研究。

于倩，女，博士，主任药师，电话-13664419002，电子信箱-819389186@qq.com

R284.3

A

2095-6258(2016)05-0914-03

2016-03-15)