脑出血灶周MMP-9的表达与脑水肿的实验研究

董　静，刘　群



脑出血灶周MMP-9的表达与脑水肿的实验研究

董静1，刘群2

目的明确脑出血后灶周脑组织不同时间点MMP-9蛋白的表达规律，在脑水肿的发生、发展过程中可能作用，相关性及临床意义。方法本研究以不同时间点高血压脑出血患者开颅手术中取的脑出血灶周组织为实验组标本，按脑出血发病时间分为6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d组。以手术入路时少量破坏的脑组织做为对照组标本，通过干湿比重法测脑组织含水量，同时应用HE染色，RT-PCR方法观察各时间点各组脑出血灶周脑组织MMP-9的表达变化。结果(1)脑出血灶周脑组织含水量的变化：脑出血后灶周脑水肿程度随出血时间的延长逐渐增加，在出血6 h内含水量即开始增加，24 h后较6 h明显增高，3 d左右达到峰值，之后减轻(P<0.05);(2)在人脑出血血肿灶周中MMP-9圴有表达，出血组与对照组相比均有显著性意义(P<0.05)，且出血各组之间比较均有差异(P<0.05)。出血6 h 后免疫阳性细胞数开始增加，3 d 组阳性细胞数最多，之后逐渐下降。MMP-9与脑水肿成正相关。结论(1)脑出血灶周MMP-9的表达与脑水肿密切相关;(2)在高血压脑出血后脑水肿中MMP-9的异常表达起重要作用，促进脑水肿的发生，为脑出血的治疗提供新的靶点。

脑出血；MMP-9；免疫组织化学；RT-PCR

基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloporteinases-9，MMP-9)是基质金属蛋白酶(matrixmetalloporteinases，MMPs)中的重要成员，MMP-9主要作用于细胞外基质中的纤粘蛋白、层粘蛋白及Ⅳ型胶原蛋白，通过降解细胞基底膜、破坏血脑屏障，造成血管源性水肿，从而加重脑水肿。大量动物研究已证明MMP-9在脑出血(intracerebral hemorrhage，ICH)急性期与脑水肿呈正相关，但尚未在人ICH灶周脑组织中得到证实。本研究采用人ICH血肿灶周组织，应用免疫组化法观察ICH血肿周边脑组织中MMP-9蛋白的表达情况，并验证MMP-9蛋白表达与脑水肿程度之间的关系。

1　材料和方法

1.1一般资料2013年1月-2013年12月在吉林医药学院附属医院神经外科的患者，24例原发性高血压ICH，经颞叶入路行血肿清除术患者，全部为基底节区出血，所有患者均符合全国第四届脑血管病学术会议制定的ICH诊断标准。

1.2标本的抽取全部患者在经颞叶皮质“造瘘”清除血肿时，将入路通道范围内紧邻血肿的脑组织保存下来，做为实验组标本，大小约0.1～0.15 mm3，按发病时间分为<6 h、6～24 h、24 h～3 d、>3 d组。将部分患者皮质“造瘘”起始处脑组织，做为对照组标本，共6例。将所取的脑组织分两部分，一部分组织于10%福尔马林固定液中浸泡固定后石蜡包埋；一部分用液氮运送至-70 ℃冰箱冻存。连续切片进行HE染色和MMP-9免疫组化染色。另取ICH灶周边脑组织约100 mg进行脑组织含水量测定。

1.3MMP-9免疫组化SP法检测鼠抗人MMP-9单克隆抗体购于美国SANTA公司，DAB显色试剂盒、SP-9710试剂盒均购于福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组化过程按试剂盒说明进行，以PBS代替一抗作阴性对照。免疫组化染色细胞质阳性为棕黄色，胞浆呈红色，胞核呈蓝色，红细胞呈桔红色，其它成分呈深浅不同红色。数码相机拍照，在对照组和血肿周围随机各取5个视野，图像采用Motic Images advanced 3.2彩色图像分析系统，所测得的灰度值越小阳性越强，灰度值越大阳性越弱。

1.4RT-PCR方法检测MMP-9mRNA定量Rtizol裂解细胞后抽提总RNA，取1 ml测光密度值，DNA消化。使用日本Toyobo公司试剂盒逆转录体系进行cDNA合成。引物由北京鼎国昌盛生物技术有限公司设计合成，序列如下：上游：ACGTGACCTATGACATCCTGC，下游：GAGAAGAGAGGGCCCAGC。PCR体系：cDNA：2 μl，Taq酶0.25 μl，总反应体系：25 μl。PCR循环参数： 94 ℃预变性，2 min， 94 ℃变性，30 s，30次循环，55 ℃退火，30 s，30次循环，72 ℃延伸，1 min，30次循环。反应后将制备好的cDNA放-20 ℃冷冻保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析。通过凝胶成像系统进行拍照，记录结果。产物定量分析：利用ABI PRISM 7700 Sequence Detector，检测每个循环的荧光强度，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析。

1.5脑组织含水量测定采用干湿比重法测定脑组织含水量，取脑组织约100 mg，电子天平称湿重后置于105 ℃烤箱烘烤48 h至恒重，称取干重。换算公式：脑组织含水量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%，精确度为0.2 mg。

2　结　果

2.1免疫组化检测MMP-9MMP-9主要在血管内皮细胞可见表达，着色部位为细胞浆，DAB染色成棕褐色(见图1、图2)。对照组及实验组的灰度值测定(见表1)，在ICH后6 h，MMP-9阳性细胞开始增加，灰度值下降，24 h～3 d阳性细胞数最多，之后逐渐下降，灰度值上升。对照组与实验组各组相比均有统计学意义(P<0.05)，且出血组各组之间亦有差异(P<0.05)。

表1　各组MMP-9灰度值的比较

与对照组相比aP<0.05；与<6 h组比较bP<0.05；与6～24 h组比较cP<0.05；与24 h～3 d 组比较dP<0.05

2.2RT-PCR经PCR扩增后，MMP-9 mRNA表达产物在近178 bp处出现，分别于观察对照组及实验组MMP-9 mRNA在各时间点的表达，MMP-9的PCR产物相对定量分析结果(见表2、图3)，结果可见对照组中有少量表达，血肿灶周6 h出现MMP-9阳性细胞，24 h进一步增加，24 h～3 d时MMP-9阳性细胞表达达高峰，3 d后仍可见MMP-9的表达，但较3 d时下降(两组相比均有统计学意义，P<0.05)。

2.3ICH后脑组织含水量的变化在出血6 h含水量即开始增高，24 h后较6 h明显增高，3 d左右达到峰值，之后减轻(P<0.05)(见表3)。

2.4ICH组MMP-9灰度值与脑组织水含量关系用直线回归进行分析显示(见图4)：ICH后各时间点HMMP-9灰度值与脑组织水含量的变化呈负的直线相关关系(r=-0.85849，P<0.001)，24 h～3 d 显著降低(P<0.05)，3 d 达到最低；MMP-9含量与脑组织含水量均表现出一致的时相依赖性变化，即随着MMP-9表达的增加脑组织水含量也增加，且相关关系非常密切。

表2　ICH后MMP-9 mRNA表达

与对照组比较*P<0.05

表3　各组脑组织含水量的比较

与对照组相比aP<0.05；与<6 h组比较bP<0.05；与6～24 h组比较cP<0.05；与24 h～3 d组比较dP<0.05

图1　6～24 h组MMP-9阳性表达细胞(SP×400)

图2　24 h～3 d MMP-9阳性表达细胞(SP×400)

图3　MMP-9的PCR产物相对定量分析

图4　出血灶周脑组织含水量与MMP-9灰度值表达

3　讨　论

近二十余年来，已达成专家共识，凝血酶本身是引起ICH早期脑水肿的重要因素。近年来， Kawakita K等[1]在沙鼠脑实质研究中发现凝血酶可促进MMP-9的表达和激活。凝血酶诱导的炎性反应和炎性介质的释放及氧化应激反应，可使内皮细胞的MMP-9活化，导致BBB的渗透性增加[2]，与凝血酶诱导的MMPs表达、损伤血管基膜有关[3]。因此，我们考虑ICH后凝血酶和MMP-9共同参与了脑水肿的形成。本研究发现：ICH中MMP-9的表达具有以下3个特点：(1)在正常脑组织中MMP-9无表达；(2)ICH后可有大量MMP-9的表达，持续时间较短暂，3 d时达高峰；(3)MMP-9表达部位主要为神经元、胶质细胞及内皮细胞。

ICH后MMP-9在各时间点的表达出血组与对照组相比，差异具有显著性(P<0.05)，6 h MMP-9表达上升，在3 d达高峰，以后逐渐下降；MMP-9含量与脑组织含水量均表现出一致的时相依赖性变化，二者呈正相关，与国内学者在ICH患者外周血清中放射免疫法检测结果一致。目前，大量的研究表明，ICH后MMPs家族中MMP-2、MMP-3、MMP-9和MMP-12等蛋白表达或活性增加，它们从ICH4 h后表达就明显增加[4]。Power[5]等在ICH动物实验中发现MMP-2、MMP-3、MMP-9的mRNA 表达增加。Gursoy-Ozdemir等学者发现，存在脑水肿的ICH大鼠表达MMP-9，同时发生血浆蛋白的漏出，而无血浆蛋白漏出的大鼠中MMP -9表达阴性，提示MMP-9与BBB破坏有关[6]。结合以上文献，提示MMP-9的表达增加可能是ICH后早期血管源性脑水肿形成的重要原因之一[7～9]。

Lvarez-Sabin研究发现，ICH后3 d MMP-9达高峰，其含量与血肿周围水肿体积呈正相关，而其抑制剂金属蛋白酶组织抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1)的含量与血肿周围水肿体积呈负相关，说明抑制ICH后MMP-9的表达，是防治ICH后血管源性脑水肿形成的一个新的潜在途径。Abilleira等[10]研究59例发病24 h 内ICH患者血清MMP-9的含量发现，MMP-9含量升高与脑水肿的加重相关。对基底节区ICH而言，MMP-9的升高预示着病情的加重。在本实验中，我们得出的结论与Abilleira等人的结论部分相似，MMP-9表达在3 d达高峰，以后逐渐下降，MMP-9含量与脑组织含水量均表现出一致的时相依赖性变化。有研究发现，ICH后血肿周围水肿和神经功能障碍与MMP-9的表达有密切联系，MMP-9表达越显著，神经功能障碍越严重。因此，针对ICH后的脑水肿的临床治疗是关系到ICH患者预后的一项极其重要的干预措施。国内研究认为丁苯酞可能通过抑制MMP-9的表达，减少血脑屏障基底膜降解，发挥脑保护作用。

近年研究证明，MMPs被认为是血管新生的“开关”[11]。MMPs参与了ICH后的血管新生。有研究表明，在伤口愈合、新生血管形成、肿瘤侵袭转移、炎症反应及纤维化等过程中，MMPs的表达量明显增加。血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)已被证实对血管新生和神经保护或刺激神经发生有特异作用[12]，且VEGF可诱导细胞MMPs基因的转录，导致了血管新生和血管通透性增加。MMPs在脑组织的细胞外基质(extracellular matrix，ECM)恢复期重塑起到了重要作用，ECM和毛细血管内皮下基底膜的降解是血管新生的一个关键步骤，为内皮细胞增殖、新生血管的出芽、迁移、血管延伸创造条件，并且MMPs能调节内皮细胞的形状、MMPs与血管新生关系密切[13]。

综上所述，MMPs在ICH起着“双刃剑”的作用。一方面，MMPs促进组织修复，为突触重塑扫清道路，诱导血管新生；另外一方面，MMPs破坏血脑屏障，加重脑水肿，还直接损伤神经元细胞。TIMP-1和MMP-9的平衡，对于ECM完整性的保持，重塑细胞外基质方面具有重要作用。故在ICH中，调节MMP-9和TIMP-1的平衡，有可能成为ICH新的治疗策略。

[1]Kawakita K,Kawai N.Expression n of matrix,metalloproteinase-9 in thrombin-induced brain edema formatio n in rats[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2006,15(3):88- 95.

[2]Xi G,Fewel ME,Hua Y,et al.Intracerebral hemorrhage:pathophysiology and therapy[J].Neurocrit Car,2004,1:5-18.

[3]Zheng GQ,Wang XT,Wang XM,et al.Long-time course of protease activated receptor-1expression after intracerebral hemorrhage in rats[J].Neurosci Lett,2009,459:62-65.

[4]Wang Jian,Tsirka S.Neuroprotection by inhibition of matrix metalloproteinases in a mouse model of intracerebral hemorrhage[J].Brain,2005,128:1622-1633.

[5]Power C,Herry S,Del Bagnio MR,et al.Intracerebral hemorrhage induces macrophage activation and matrix metalloproteinase[J].Neural,2003,53(6):731-742.

[6]Gursoy-Ozdemir Y,Qiu J,Matsuoka N,et al.Cortical spreading depression activates and up regulates MMP-9[J].ClinInvest,2004,113(10):1447-1455.

[7]Lee JG,Lee SH,Park DW,et al.Phosphatidic acid as a regulator of matrix metalloproteinase-9 expression via the TNF-2007[J].FEBS Lett,2007,581(4):787-793.

[8]Nguyen J,Gogusev J,Knapnougel P,et al.Protein tyrosine kinas and p38 MAP kinas pathways am involved in stimulation of matrix metalloproteinase-9 by TNF-a in human coenocytes[J].Immunology Letters,2006,106(1):34-41.

[9]Zhao CH,Ling ZD,Desai BS,et al.Minocyeline and TNF-a knockout attenuates neunro inflammation and prevents blood-brain barrier(BBB)leak age following MPTP treatment [J].Experimental Neurology,2006,198(2):597-602.

[10]Abilleira S,Montaner J,Molina CA,et al.Matrix metalloproteinase-9 concentration after spontaneous intracerebral hemorrhage[J].J Neurosurgeon,2003,99(1):65-70.

[11]Bergers G,Brekken R,MeMahon G,et al.Matrix metalloproteinase-9 trigger the angiogenic switch during careinogenesis[J].Nat Cell Biol,2000,2(10):737-744.

[12]Keep RF,Xi G,Hua Y,et al.The deleterious or beneficial effects of different agents in intracerebral hemorrhage:think big,think small,or is hematoma size important[J].Stroke,2005,36(7):1594-1596.

[13]Sottile J.Regulation of angiogenesis by extracellular matrix[J].Biochem Bio Phys Acta,2004,1654(1):13-22.

Experimental study on the expression of cerebral hemorrhage perifocal MMP-9 and brain edema

DONGJing，LIUQun.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofJilinMedicalUniversity,Jilin132021,China)

ObjectiveTo clear the cerebral hemorrhage perifocal brain tissue at different time points of MMP-9 protein expression pattern the possible role of the occurrence and development of cerebral edema correlation and its clinical significance.MethodsThe cerebral hemorrhage foci were taken during the craniotomy operation for patients with cerebral hemorrhage at different time points.The patients were divided into<6 h，24 h～3 d，6～24 h and >3 d groups according to the time of onset.To operative cranial path away from the hematoma at a little damage of brain tissue do as the samples in the control group by dry wet weighing method in measuring the brain water content，and immunohistochemical staining and RT-PCR methods observe changes of brain tissue around the MMP-9 expression in each group at different time points lesions.Results(1)The water content of brain tissue changeds，cerebral hemorrhage cerebral edema with bleeding time increased，in 6 h containing water hemorrhage increased significantly，after 24 h significantly increased，peaked in about three days，then reduced (P<0.05).(2)In the human brain hemorrhage perifocal MMP-9 shall have expression expressed，as compared with the control group，hemorrhage group were significant(P<0.05) compared to and bleeding between groups comparison showed a significant difference (P<0.05).The number of immune positive cells increased after bleeding 6 h，and the cell numbers of 24 h～3 d cells was the most，then decreased gradually.MMP-9 was positively related to cerebral edema.Conclusion(1)The expression of MMP-9 in the human brain was significantly higher which was closely related to cerebral edema.(2)Abnormal expression of MMP-9 plays an important role in cerebral edema after hypertensive intracerebral hemorrhage and promotes the occurrence of cerebral edema and provides a new target for the treatment of cerebral hemorrhage.

Intracerebral hemorrhage；MMP-9；Immunetissuechemistry；RT-PCR

1003-2754(2016)02-0157-04

2015-10-23；

2015-11-29

吉林省卫生厅课题 (No.2012ZC017)

(1.吉林医药学院附属医院神经内科,吉林 吉林 132012；2.吉林大学白求恩第一医院神经内科，吉林 长春 130021)

刘群，E-mail：liufanxiaolin@163.com

R743.34

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