3 种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

刘忠梅，徐义刚，曲 敏，莫春生，刘新亮，李苏龙,（.黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨 5000；.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 50076）

3 种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

刘忠梅1，徐义刚1，曲 敏2，莫春生2，刘新亮1，李苏龙1,*
（1.黑龙江出入境检验检疫局，黑龙江 哈尔滨 150001；2.哈尔滨商业大学食品工程学院，黑龙江 哈尔滨 150076）

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction，Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3 种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄 球菌femA基因、沙门氏菌invA基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因，设计3 对特异性引物，并与通用引物连接组成Tem-PCR引物，通过反应条件优化，建立了Tem-PCR检测方法。结果显示，建立的Tem-PCR方法特异性强，对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。

靶序列富集多重PCR方法；沙门氏菌；金黄色葡萄球菌；志贺氏菌

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌是引起食物中毒的主要常见食源性致病菌[1-6]。目前，针对食源性致病菌检测的主要方法有传统生化鉴定法[7]、聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）法[8-13]、PCR结合变性高效液相色谱分析法[14-19]及基因芯片法[20-21]等。传统生化鉴定方法操作繁琐、检测时间 长，完成鉴定工作通常需要5～10 d时间，不能满足食源性致病菌快速检测的要求。免疫学为基础建立的检测方法，虽然检测快速，但灵敏性差、假阳性高。PCR方法因具有检测灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，在病原微生物的检测中发挥了巨大的作用，成为主要采用的检测方法[8-13]。其中多重PCR检测通量高，可以实现多种致病菌的同时检测，但建立多重PCR方法时需要反复优化各引物对的浓度，以应对不同引物对扩增效率的不均衡性。

靶序列富集多重PCR（target-enriched multiplex-PCR，Tem-PCR）技术是一种新颖的多重PCR技术，引物设计与扩增方式比较独特，它巧妙地突破了多重PCR的瓶颈。它的原理是：首先设计一对（一条）没有亲源性通用引物，再针对每一种靶序列，设计一对特异性引物，将它与通用引物连接，构成特异性长引物。在PCR反应中，特异性长引物浓度极低，在最初循环中先发挥作用，富集靶序列。通用引物浓度较高，在后续循环中独立发挥作用，保持同一扩增效率，解决了传统多重PCR中不同引物扩增效率不均衡的难题[22-25]。本研究利用该技术，建立了同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的Tem-PCR检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

实验菌株沙门氏菌（ATCC 10708、CMCC 50004、CMCC 50115）、志贺氏菌（CMCC 51592、ATCC 12022）、单核细胞增生李斯特菌（CMCC 54002）、金黄色葡萄球菌（CMCC 26003、ATCC 29213、ATCC 49444）、创伤弧菌（ATCC 27562）、溶藻弧菌（ATCC 17749）、霍乱弧菌（ATCC 25872）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、肠出血性大肠杆菌O157:H7（ATCC 35150）、大肠杆菌（ATCC 25922）、产肠毒素大肠杆菌（ATCC 35401）、肠侵袭性大肠杆菌（ATCC 43893）、肠致病性大肠杆菌（ATCC 43887）、阪崎肠杆菌（ATCC 51329）、空肠弯曲菌（ATCC 33560）、变形杆菌（ATCC 49027）、蜡样芽孢杆菌（ATCC 10987）由黑龙江出入境检验检疫局提供。

1.1.2 试剂

细菌基因组DNA提取试剂盒 北京Tiangen科技有限公司；Taq DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP） 日本TaKaRa公司；培养基 北京兰伯瑞生物技术公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

Tem-PCR引物组由特异性长引物和通用引物组成：首先设计两段异源性基因序列，作为通用引物（表1中划线部分）；然后分别以金黄色葡萄球菌femA基因、沙门氏菌invA基因和志贺氏菌ipaH基因为靶基因，选择基因保守区域设计3 对特异性引物（表1中未划线部分），将通用引物与特异性引物连接构成特异性长引物（表1）。引物由上海生工公司合成。

表1 Tem-PCR 引物序列Table 1 Primers designed for Tem-PCR assay

1.2.2 核酸提取

采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取实验菌株基因组DNA，具体操作详见说明书。

1.2.3 特异性长引物浓 度优化

反应体系（25 μL）为：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L通用引物2 μL，特异性长引物终浓度分别为20、40、80 nmol/L和200 nmol/L，细菌基因组DNA模板各0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，去离子水 补充至25 μL。经琼脂糖凝胶电泳检测，确定特异性长引物的最佳浓度。

1.2.4 Tem-PCR扩增步 骤的优化

分别采用二步扩增法和三步扩增法优化Tem-PCR反应条件，经凝胶电泳检测，以确定Tem-PCR最佳反应条件，具体方案见表2。

表2 Tem-PCR扩增方案Table 2 Tem-PCR protocols

1.2.5 Tem-PCR方法的简易性评价

利用设计的3 对特异性引物（表1中未划线部分），不经过引物浓度优化，直接进行多重PCR扩增，扩增效果与Tem-PCR方法进行比较。

1.2.6 Tem-PCR方法的灵敏度实验

分别将菌体浓度约为2.0×108、1.1×108CFU/mL和1.2×108CFU/mL的金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌纯培养液进行10 倍梯度稀释，采用试剂盒法提取每个稀释度细菌基因组DNA，以此作为模板进行Tem-PCR检测，经凝胶电泳检测以确定该方法的灵敏度。

1.2.7 Tem-PCR方法的特异性实验

利 用建立的Tem-PCR方法检测1.1.1节所示菌株，以验证本方法的特异性。

1.2.8 Tem-PCR方法的应用

将未检出目标菌的猪肉、牛奶和香肠食品样品分成两组：一组样品人工随机组合污染金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌。即猪肉、牛奶和香肠3 种食品各取10 g（或mL），随机组合加入沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的培养液各10 mL，然后加营养肉汤至100 mL，以8 000～10 000 r/min转速均质，以此作为模拟样品。污染量为2 个水平：第1水平沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的污染量分别为1.1×104、2×104CFU/mL和1.2×104CFU/mL，第2水平分别为1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL。另一组样品作为阴性对照。两组样品分别采用Tem-PCR法和国标法[26-28]进行检测，检测结果进行符合性验证。

2 结果与分析

2.1 特异性长引物浓度优化

图1 特异性长引物浓度优化Fig.1 Optimization of the concentration of specific long primers

如图1所示，随着特异性长引物浓度的增加，PCR产物浓度逐渐增大，当特异性长引物浓度为80 nmol/L时，3种致病菌靶基因的扩增条带最清晰；当特异性长引物浓度大于80 nmol/L时，PCR扩增效率出现不均衡。因此，特异性长引物最佳反应浓度为80 nmol/L。

2.2 Tem-PCR扩增步骤的优化

图2 Tem-PCR扩增步骤的优化Fig.2 Optimization of the Tem-PCR procedure

图2显示，采用三步扩增法能够高效地扩增出3 条目标带（图2中泳道1），而二步法只扩增出了2 条目标带（图2中泳道2）。三步扩增法中，第1步保证了特异性引物与细菌基因组DNA模板结合，完成靶基因的初步扩增；第2步保证了特异性长引物与初步扩增的靶基因模板结合，完成靶基因的富集；第3步保证了通用引物与富集的模板结合，完成指数级扩增。二步扩增法中，由于特异性长引物与模板不能有效结合，无法发挥富集作用，扩增出现不均衡。因此，Tem-PCR扩增步骤优化为三步法。

2.3 Tem-PCR方法的简易性

利用3 对特异性引物，未经引物对浓度优化，直接进行常规多重PCR扩增，其扩增效果与Tem-PCR方法进行比较。如图3所示，经Tem-PCR能高效地扩增出3 条目标带，而常规多重PCR方法由于未优化引物浓度，导致扩增效率不均衡：沙门氏菌扩增条带明显，志贺氏菌条带微弱，金黄色葡萄球菌则完全没有条带。结果证明Tem-PCR方法不用优化不同引物对浓度，简化了方法建立的过程。

2.4 Tem-PCR方法的检测灵敏度

图3 Tem-PCR方法和常规多重PCR方法扩增效果的对比Fig.3 Comparison of the amplification results using Tem-PCR and traditional multiplex PCR

将已知菌体浓度的3 种细菌分别经105倍稀释后，利用建立的Tem-PCR方法均能同时有效地扩增出3 种致病菌的靶基因片段（图4），显示该Tem-PCR方法检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的灵敏度分别为1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL，与传统多重PCR灵敏度相当。

图4 Tem-PCR灵敏度Fig.4 Sensitivity of the Tem-PCR assay

2.5 Tem-PCR方法的检测特异性

利用建立的Tem-PCR方法检测1.1.1节所示菌株，结果显示：沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌均为Tem-PCR阳性结果，其他为阴性结果，且未见非特异性扩增条带出现，显示了良好的检测特异性（图5）。

图5 Tem-PCR方法的检测特异性Fig.5 Specificity of the Tem-PCR assay

2.6 Tem-PCR检测方法的实用性

采用建立的Tem-PCR方 法对金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和沙门氏菌随机组合污染的模拟食品样品、对照样品进行检测，结果（图6）显示，利用该方法能够准确地检测出第1水平污染样品中的致病菌，与国家标准法检测结果相符合，其他样品为阴性。这表明Tem-PCR方法检测模拟污染食品的灵敏度是纯培养液的10 倍，实际应用时灵敏度降低了10 倍。但是只要食品污染水平高于灵敏度，该方法就具有良好的实用性。

图6 Tem-PCR的适用性Fig.6 Applicability of Tem-PCR

3 讨论与结论

Tem-PCR方法的独特之处在于特异性长引物浓度极低，用在PCR的最初几个循环中富集目标序列，只有通用引物浓度很高[22]，通用引物浓度通常是特异性长引物浓度的10 倍以上。在后扩增的几十个循环中，所有目标基因都采用同一引物（通用引物）进行扩增，所以扩增效率相同，扩增产物量相当，解决了传统多重PCR中不同引物扩增效率不均衡问题。通用引物的高浓度使用是Tem-PCR方法的核心。

Tem-PCR方法比较简便，相比传统多重PCR，不需要调整优化各对引物浓度。Tem-PCR方法也是一种多重PCR方法，其检测灵敏度与传统多重PCR相当。Tem-PCR方法作为一种高通量的检测方法，其灵敏度不及荧光PCR，扩增时间也较长，但它可开发为荧光Tem-PCR方法。

本研究建立了同时检测沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的Tem-PCR方法，有效地解决传统多重PCR方法扩增效率不均衡的难题，方法建立简便实用，为食源性致病菌的高通量检测提供了新手段。

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Development of Target-Enriched Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Three Foodborne Pathogens

LIU Zhongmei1, XU Yigang1, QU Min2, MO Chunsheng2, LIU Xinliang1, LI Sulong1,*
(1. Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 2. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

In this study, a target-enriched multiplex PCR (Tem-PCR) assay for simultaneous detection of Salmonella, Staphylococcus aureus and Shigella was developed. Based on the S. aureus femA gene, the Salmonella invA gene and the Shigella ipaH gene, three pairs of specific primers together with a universal primer were designed. Following the optimization of reaction conditions, the Tem-PCR assay was successfu lly established. Results showed that the Tem-PCR assay was highly specific to the target bacteria with a sensitivity of 1.1 × 103CFU/mL, 2 × 103CFU/mL and 1.2 × 103CFU/mL for Salmonella, S. aureus and Shigella, respectively. The Tem-PCR assay can effectively improve the balanc e of amplification efficiencies of the primers e mployed in traditional multiplex PCR.

Tem-PCR assay; Salmonella; Staphyloc occus aureus; Shigella

10.7506/spkx1002-6630-201604033

Q789；R155.5

A

1002-6630（2016）04-0186-05

刘忠梅, 徐义刚, 曲敏, 等. 3 种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 186-190.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604033. http://www.spkx.net.cn

LIU Zhongmei, XU Yigang, QU Min, et al. Development of target-enriched multiplex PCR assay for simultaneous detection of three foodborne pathogens[J]. Food Science, 2016, 37(4): 186-190. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604033. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

公益性行业（质检）科研专项（201310126）

刘忠梅（1976—），女，高级农艺师，博士，研究方向为病原检测。E-mail：liuzhongmei@126.com

*通信作者：李苏龙（1966—），男，研究员，硕士，研究方向为微生物检测。E-mail：ciqlsl@aliyun.com