响应面法优化制备魔芋葡甘聚糖-大豆分离蛋白混合凝胶

徐晓萍，张亚宁，樊 巧，陈厚荣，张甫生（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

响应面法优化制备魔芋葡甘聚糖-大豆分离蛋白混合凝胶

徐晓萍，张亚宁，樊 巧，陈厚荣，张甫生*
（西南大学食品科学学院，重庆 400715）

为提高多糖-蛋白混合物稳定性，改善彼此性能并探究制备过程中各因素对多糖-蛋白混合凝胶成型及性能的影响，以魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）和大豆分离蛋白（soybean protein isolate，SPI）为试材，制成KGM-SPI混合凝胶，研究制备工艺对其凝胶强度和持水性的影响。在单因素试验的基础上，取KGM-SPI总质量分数、KGM与SPI配比、KCl浓度和Ca(OH)2添加量为自变量，凝胶强度为响应值，建立混合凝胶强度的二次回归方程，并通过响应面分析得到优化制备条件为：KGM-SPI总质量分数4.5%、KGM与SPI配比3∶1、KCl浓度0.13 mol/L、Ca(OH)2添加量0.15%。此条件下混合凝胶强度验证值为2.758 N，与预测值2.779 N相近。通过对优化前后凝胶质构特性进行了对比分析，均证实优化结果可靠。

魔芋葡甘聚糖；大豆分离蛋白；混合凝胶；响应面法

食品体系是由多种组分混合而成的复杂体系，多糖和蛋白质是构成食品的两大重要组分。但多糖-蛋白共混体系多处于亚稳态，在加工、贮运等实际应用中常出现相分离，导致多糖-蛋白基产品在食品、药品及材料等领域的应用受到严重阻碍[1-4]。因共混体系质构、流变等特性受分子结构、浓度、环境pH值和离子强度等影响[5]，通过调控这些因素可显著改善多糖-蛋白共混体系的稳定性。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是一种继淀粉和纤维素之后、来源丰富的可再生天然中性多糖，可以吸收100倍于自身体积的水分形成水溶性胶体[6]，具亲水性、凝胶性、黏结性、成膜性及低热量、低脂肪、高膳食纤维等优良特点[7]，被广泛用于食品、医学、生物学等领域。大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）含有丰富的氨基酸、钙、磷、铁和维生素，且胆固醇含量低[8]，为目前来源最为丰富的植物蛋白[9]，具有乳化、胶凝、成膜等多种特性，已应用于各类食品中[10-11]。以魔芋葡甘聚糖与大豆分离蛋白来研究多糖与蛋白共混体系极具代表性，目前关于KGM与SPI共混体系的研究，仅有关于体系宏观性质及部分初级结构研究[12-15]的报道，混合体系制备过程中各因素对其性质影响方面的研究较少[16-17]。KGM为吡喃型Glu和吡喃型Man以β-1,4-糖苷键连接而成的亲水性非离子型多糖，维持其双螺旋构象的乙酰基在碱性条件下加热会被脱除，双螺旋开环[18]，更多地与SPI通过氢键作用[19]形成网络结构，可通过调节浓度、配比、离子强度和pH值等增强KGM和SPI分子链间相互作用，基于此，本研究通过单因素试验研究制备过程中KGM-SPI质量分数、配比、离子浓度等对KGM-SPI混合凝胶的影响，并采用响应面法研究各因素间相互作用对混合凝胶性质的影响，优化凝胶制备条件，改善KGMSPI混合凝胶的性能，以期为多糖和蛋白混合凝胶的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

KGM（食品级，纯度≥95%） 上海北连生物科技有限公司；SPI（食品级，纯度≥90%） 郑州哼多宝化工有限公司；氯化钾（分析纯） 重庆北碚化学试剂厂；氢氧化钙（分析纯） 重庆川东化工公司。

1.2 仪器与设备

JJ-1型精密增力电动搅拌器 金坛市城东新瑞仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅 常州奥华仪器有限公司；SL602N型高精数显电子天平 上海民桥精密科学仪器有限公司；TA.XT2i型物性测定仪 英国Stable Micro System公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 KGM-SPI混合凝胶的制备流程

将一定量的SPI缓慢加入到有磁力搅拌器搅拌的去离子水中，边搅拌边添加，待SPI分散均匀，将称量好的KGM缓慢加入到SPI分散液中，充分搅拌以保证KGM完全分散到SPI水分散液中，加入凝固剂Ca(OH)2充分搅拌混合均匀，平整表面后于95 ℃恒温水浴30 min形成凝胶，立即冷却到室温，并存放在4 ℃过夜待测。

1.3.2 KGM-SPI混合凝胶的性能测定

1.3.2.1 KGM-SPI混合凝胶的质构特性

使用质构仪的质构分析模式测定凝胶质构特性。操作条件：p0.5探头，测试前速率2.0 mm/s，形变量50%，测试速率1.0 mm/s，测试后速率5 mm/s，触发力0.05 N。每个试样均做10 个平行，测定凝胶强度、黏性、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性。

1.3.2.2 KGM-SPI混合凝胶的持水性

将凝胶切成均匀的矩形颗粒置于10 mL离心管中，于冷冻离心机中12 000×g、4 ℃离心10 min，滤纸吸干管内可见水分，称质量。持水率按式（1）计算：

式中：m1为离心管和离心后凝胶质量/g；m2为离心管和离心前凝胶质量/g；m3为离心管质量/g。

1.3.3 试验设计

1.3.3.1 单因素试验设计

选取对试验影响较大的因素：KGM-SPI总质量分数（1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、5%）、SPI与KGM配比（3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2）、KCl浓度（0.02、0.05、0.08、0.11、0.15、0.2、0.3 mol/L）、Ca(OH)2添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），研究各因素对凝胶性能的影响。试验均做3 个平行。

1.3.3.2 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，以凝胶强度为响应值，设计四因素三水平的响应面试验，如表1所示，优化各个工艺参数。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.4 数据统计与分析

利用Origin 7.5与Design-Expert处理分析实验数据，实验均做3 次以上平行，取平均值，结果以标准差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 KGM-SPI总质量分数对混合凝胶性能的影响

设定KGM与SPI配比为6∶4，KGM-SPI总质量分数按1.3.3.1节制备凝胶，测定其凝胶强度及持水性，如图1所示。

图1 KGM-SPI总质量分数对混合凝胶强度和持水性的影响Fig.1 Effect of total concentration of KGM and SPI on the gel strength and water-holding capacity of KGM-SPI mixed gels

凝胶强度主要是由形成凝胶的物质间通过共价键合、静电、氢键、疏水作用等发生交联和聚集形成三维网状结构的致密程度决定[10]。由图1可知，随着KGMSPI总质量分数的增加，混合凝胶的凝胶强度和持水性均呈上升趋势，质量分数为4%时，凝胶强度达到最大且持水性最高。这是因为开始时混合物中KGM和SPI含量较低，两者相互作用形成的凝胶结构不够致密，随着混合物总质量分数的增加，两者相互作用机会增多形成网络结构更加致密，凝胶强度逐渐增强。对于持水性，由于KGM和SPI均具有胶凝性结合了一部分水分，同时两者相互作用形成的网络结构将一部分水分截留，持水性提高，此结果和其他蛋白质与多糖所形成混合凝胶持水性的研究一致[20-21]。随后持水性呈明显下降趋势是因为KGM与SPI总量过多，不能充分溶解[22]，凝胶相互结合不紧密，因而结合水的能力下降。综合凝胶强度高，持水性较高角度考虑，KGM-SPI混合物总质量分数为3.5%～5.0%可满足凝胶制备要求。

2.2 KGM-SPI配比对混合凝胶性能的影响

设定KGM-SPI总质量分数为3.5%，KGM与SPI的配比按1.3.3.1节制备凝胶，测定其凝胶强度和持水性，如图2所示。

由图2可知，随着KGM-SPI配比的增大，混合凝胶的凝胶强度不断增大，持水性逐渐提高；而后随着配比继续增大，凝胶强度和持水性逐渐趋于稳定。这是因为随着KGM-SPI配比增大，KGM在混合物中比例增加，其凝胶强度强于蛋白质[23]，且KGM具有较强的亲水性，其与SPI的相互作用有助于提高SPI的溶解性，进而促进两者间的相互作用[16]，故凝胶强度不断增大。对于持水性而言，同样是因为KGM比例增加引起的，因KGM本身可通过氢键、偶极等作用力吸收足够多的水分[6]，且其与SPI形成的多孔网络结构也对水分具有束缚作用[23]，故可使持水性提高。当配比至6∶4后，凝胶强度上升速率变缓，持水性也趋于稳定，这可能是由于KGM和SPI相互作用存在最佳比例造成的，如丁金龙等[10]研究得出魔芋胶-大豆蛋白比例为5∶4时，混合凝胶的凝胶强度和持水性达到最大。为此，6∶4配比应为KGM和SPI较佳的配比，此时分子间相互作用较为显著，且形成较为致密网络结构。随后KGM配比继续增加，凝胶强度稍有增加，持水性基本不变，二者变化均不如前期显著。综上，根据实际操作经验和共混物的性能分析结果，试验考虑KGM和SPI配比为6∶4～7∶3。

图2 KGM-SPI配比对混合凝胶强度和持水性的影响Fig.2 Effect of KGM/SPI ratio on the gel strength and water-holding capacity of KGM-SPI mixed gels

2.3 KCl浓度对KGM-SPI混合凝胶性能的影响

KCl的加入可促进KGM进一步溶解，防止与SPI发生相互作用前结块[6]。设定KGM与SPI配比为7∶3，总质量分数为3.5%，KCl浓度按1.3.3.1节制备凝胶，测其凝胶强度和持水性，如图3所示。

图3 KCl浓度对KGM-SPI混合凝胶强度和持水性的影响Fig.3 Effect of KCl concentration on the gel strength and water-holding capacity of KGM-SPI composite gels

由图3可知，随着KCl浓度的增大，混合凝胶的凝胶强度呈先增大后减小并逐渐趋于平稳的趋势。KCl的浓度在0.02～0.11 mol/L时，凝胶强度不断增强；浓度处于0.11 mol/L时，混合凝胶的凝胶强度达到最大；当KCl浓度大于0.11 mol/L后，凝胶强度逐渐下降，且当浓度超过0.15 mol/L时，混合凝胶的凝胶强度呈基本稳定。对于混合凝胶的持水性，当加入KCl浓度在0.02～0.08 mol/L时，持水性随浓度的上升而提高；浓度处于0.08 mol/L时，持水性达到最高；随后浓度继续增大，混合凝胶的持水性呈降低趋势并逐渐趋于稳定。这是因为KGM的扩散迁移速度远远小于水分子扩散迁移速度，其发生溶胀，颗粒表面产生一层薄高聚糖黏稠溶液相互黏联结块[6]，不利于溶解同时妨碍其与水和SPI相互作用，当加入KCl后，KCl在其中起到稀释分散剂的作用[24]，促进KGM溶解，并进一步与SPI相互作用，同时盐的加入使得蛋白溶液有一定的离子强度，提高蛋白质溶解性[25]，混合凝胶的凝胶强度增大，持水性提高。

随着KCl浓度继续增大，部分SPI发生盐析效应，且长时间加热使得蛋白基团发生化学反应，如巯基氧化，形成聚集产生相分离，这均不利于混合凝胶形成连续的凝胶网络结构[22]，导致混合凝胶的凝胶强度下降，持水性下降。同时在高盐浓度条件下盐的水化能力强于蛋白和多糖，从而夺去了多糖分子和蛋白质外围的水膜，使复合凝胶的持水性下降，这与Çakir等[26]对乳清分离蛋白-卡拉胶混合凝胶持水性的研究结果一致。因此根据上述分析结果及从凝胶强度高，持水性较高角度考虑，试验中KCl浓度选择0.08～0.15 mol/L为宜。

2.4 Ca(OH)2添加量对KGM-SPI混合凝胶性能的影响

Ca(OH)2作为混合凝胶的助凝剂，主要是OH－离子对共聚物分子之间相互作用形成网络结构产生影响，从而影响凝胶强度和持水性[27-28]。设定KGM与SPI配比为6∶4，总质量分数为3.5%，Ca(OH)2添加量按1.3.3.1节制备凝胶，测定其凝胶强度和持水性，如图4所示。

图4 Ca(OOHH))2对KGM-SPI复合凝胶强度和持水性的影响Fig.4 Effect of Ca(OH)2dosage on the gel strength and water-holding capacity of KGM-SPI composite gels

由图4可知，当Ca(OH)2添加量在0.05%～0.15%时，凝胶强度随其添加量增加而增加；当添加量大于0.15%时，随着Ca(OH)2添加量继续增加，混合凝胶的凝胶强度逐渐降低。而对于持水性，Ca(OH)2添加量在0.05%～0.10%时，随着添加量的增加，持水性呈下降趋势；0.10%～0.15%时，持水性趋于稳定；随后混合凝胶的持水性随添加量的增加呈上升趋势。KGM为亲水性非离子型多糖，其分子中没有强疏水基团，与SPI不可能存在强的疏水作用和静电作用，故氢键作用是其主要相互作用力[10]；而KGM的胶凝和胶溶作用不仅受阴离子类型影响，还受体系pH值影响[29]，随着OH－浓度的上升，促进了胶凝作用，从而促进凝胶稳定结构的形成，同时又增加了胶溶力，使凝胶结构的破坏增加[22]，故这两种作用大小的平衡决定了凝胶性状的具体变化。

当Ca(OH)2添加量在0.05%～0.10%之间时，胶溶作用弱于凝胶作用，凝胶强度增强；同时也因胶溶及OH－夺取原有凝胶中KGM，凝胶网络破坏，部分水流出，持水性下降。在0.10%～0.15%之间时，胶溶作用与溶胶作用趋于平衡，持水性也趋于平衡；但因KGM富含乙酰基[7]，OH－浓度的升高，可使同等浓度KGM凝胶强度在一定范围内继续增强。而在Ca(OH)2添加量大于0.15%时，胶溶作用强于凝胶形成作用，凝胶强度下降，同时OH－离子浓度过高导致蛋白质变性，水分子易通过氢键作用在多肽链中的—CO—和—NH—中心形成多分子水网[30]，导致持水力增强，持水性提高。根据复合凝胶强度的大小和实际食品的酸碱性要求，之后的试验选取Ca(OH)2的添加量0.15%左右为宜。

2.5 响应面试验优化

2.5.1 响应面试验结果

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Experimental design and results of response surface design

在单因素试验的基础上，以KGM-SPI总质量分数、配比、KCl浓度、Ca(OH)2添加量为响应因素，凝胶强度为响应值进行试验，试验设计及结果如表2所示。

2.5.2 回归模型建立及方差分析

利用Design-Expert软件对表2数据进行逐步回归拟合，所得回归方程如下：

表3 凝胶强度回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the quadratic model of gel strength

由表3可知，该模型4 个因素A、B、C、D对混合凝胶的凝胶强度影响均极显著（P＜0.01）；AD、BC、BD、CD的交互作用对其有极显著影响（P＜.01），因素AB、AC的交互作用对其影响不显著（P＞0.05）；A2、B2、C2、D2对其有极显著影响（P＜0.01）。失拟项（P＝0.994 3）不显著，R2＝0.998 3表明该模型的拟合度良好，能很好地分析和预测混合凝胶的凝胶强度在不同制备条件下的变化。

2.5.3 响应面分析

图5 各因素交互作用对KGM-SPI混合凝胶强度的影响Fig.5 Response surface graphs showing the effects of various factors on the gel strength of KGM-SPI mixed gels

由表3和式（2）可知，KGM-SPI总质量分数、配比、KCl浓度、Ca(OH)2添加量均为影响混合凝胶凝胶强度的主要因素，各因素间交互影响如图5所示。KGM-SPI总质量分数与配比、KGM-SPI总质量分数与Ca(OH)2添加量间交互作用不显著（图5a、5b），其余4 组交互显著，与方差分析表结果一致。图5c显示，当KCl浓度在较低水平时，KGM-SPI总质量分数对凝胶强度的影响比较显著，凝胶强度随着总质量分数的增加显著升高。在KCl浓度0.11～0.15 mol/L、KGM-SPI总质量分数3.5%～4.7%时的响应面坡面极陡且存在极值，二者交互作用显著。图5d显示，当Ca(OH)2添加量在较低水平时，KGM-SPI配比对凝胶强度的影响比较显著，凝胶强度随配比的增加显著升高。在KGM-SPI配比2.00∶1～3.50∶1、Ca(OH)2量0.10%～0.18%时的响应面坡面极陡且存在极值，二者的交互作用显著。KGM-SPI配比与KCl浓度、Ca(OH)2添加量与KCl浓度间交互作用见图5e、5f。曲面图的等高线呈椭圆形，表明配比与KCl浓度、Ca(OH)2添加量与KCl浓度间交互作用对凝胶强度有显著影响，此与单因素试验结果一致。

2.5.4 混合凝胶制备工艺的优化与验证

由软件对数据分析得知，KGM-SPI总质量分数4.66%、配比3.23∶1、KCl 0.13 mol/L、Ca(OH)2添加量0.15%条件下所制备凝胶强度为2.779 N。将最佳条件调整为KGMSPI总质量分数4.5%、配比3∶1、KCl浓度0.13 mol/L、Ca(OH)2添加量0.15%。此条件下测得的凝胶强度为2.758 N，与理论值相近，可见回归模型能很好地预测混合凝胶的性能，优化结果可靠。

2.6 KGM-SPI混合凝胶质构分析

选取KGM和SPI总质量分数3.5%、配比7∶3制备凝胶并作为空白样品，对空白样品、空白样品添加0.15% Ca(OH)2，空白样品添加0.15% Ca(OH)2和0.08 mol/L KCl进行质构分析，与优化后的凝胶进行对比，结果见表4。

表4 凝胶质构性能分析Table 4 Texture properties of mixed gels

由表4可知，与空白样品等相比，随着制备条件的不断优化，混合凝胶的凝胶强度、弹性、内聚性、胶着性和咀嚼性均增强，胶着性和咀嚼性等的提高表明把凝胶咀嚼成能够咀嚼状态和吞咽状态所需要的能量均增大[31]，这反映出经优化后的条件可起到改善混合凝胶质构性能的作用；同时表中也显示黏性呈下降趋势，一般说来，黏性越大，凝胶越脆，刚性不足，即凝胶强度越弱[31]；优化后样品黏度下降，也进一步证实在优化条件下所制备的KGM-SPI复合凝胶凝胶强度得到提高。综上，回归模型所得出的优化条件下制备的KGM-SPI混合凝胶确实表现出良好的性能，优化结果可靠。

3 结 论

通过适当调节KGM-SPI质量分数、配比、KCl浓度、Ca(OH)2添加量后，KGM-SPI混合凝胶的凝胶强度和持水性均有所改善。各因素均为影响凝胶强度和持水性的主要因素，通过响应面优化得到混合凝胶最优制备条件为：KGM-SPI质量分数4.5%、KGM与SPI配比3∶1、KCl浓度0.13 mol/L、Ca(OH)2添加量0.15%；在此条件下制得的凝胶强度为2.758 N，与理论值2.779 N相近。此外，对优化后制成凝胶与优化前等凝胶样品进行质构分析比较，也进一步证实优化条件下制备的KGM-SPI混合凝胶的性能良好，优化结果可靠。

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Optimization of the Formulation of Konjac Glucomannan-Soybean Protein Isolate Mixed Gel by Response Surface Methodology

XU Xiaoping, ZHANG Yaning, FAN Qiao, CHEN Hourong, ZHANG Fusheng*
(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

This study aimed to enhance the compatibility of polysaccharide-protein mixtures, to improve their performance and to study the effects of various factors on gelation and gel properties. The effects of formulation variables on gel strength and water-holding capacity of konjac glucomannan (KGM)-soybean protein isolated (SPI) mixed gels were examined. Optimization of formulation variables was carried out using combination of single factor method and response surface methodology. A quadratic regression model was built using KGM to SPI ratio, total concentration, KCl concentration and Ca(OH)2dosage as the independent variables and gel strength as the response. Results showed that the optimum conditions for preparing the mixed gel were determined as follows: mixed gel concentration, 4.5%; KGM/SPI ratio, 3:1; KCl concentration, 0.13 mol/L; and Ca(OH)2dosage, 0.15%. Under these conditions, the gel strength of SPI-KGM gels was experimentally 2.758 N, approaching to the predicted value of 2.779 N. In addition, the texture properties of the mixed gels were analyzed before and after the optimization, and the results indicated that the optimization was reliable.

konjac glucomannan (KGM); soybean protein isolate (SPI); mixed gel; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201604008

TS210.4

A

1002-6630（2016）04-0044-07

徐晓萍, 张亚宁, 樊巧, 等. 响应面法优化制备魔芋葡甘聚糖-大豆分离蛋白混合凝胶[J]. 食品科学, 2016, 37(4): 44-50.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604008. http://www.spkx.net.cn

XU Xiaoping, ZHANG Yaning, FAN Qiao, et al. Optimization of the formulation of konjac glucomannan-soybean protein isolate mixed gel by response surface methodology[J]. Food Science, 2016, 37(4): 44-50. (in Chinese with English abstract)

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604008. http://www.spkx.net.cn

2015-05-28

西南大学博士基金项目（SWU111067）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31301599）

徐晓萍（1990—），女，硕士研究生，研究方向为碳水化合物资源开发与利用。E-mail：891865909@qq.com

*通信作者：张甫生（1983—），男，讲师，博士，研究方向为碳水化合物、食品非热加工。E-mail：zfsswu@163.com