生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

徐萌萌，张　红，何　姣，涂　璇，颜　霞，黄丽丽

(1 西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 植物保护学院，c 理学院， 陕西 杨凌 712100；2 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；3 三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌 443002)



生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

徐萌萌1a,2，张红1c,2，何姣1a,2，涂璇3，颜霞1a,2，黄丽丽1b,2

(1 西北农林科技大学 a 生命科学学院，b 植物保护学院，c 理学院， 陕西 杨凌 712100；2 旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西 杨凌 712100；3 三峡大学 生物与制药学院,湖北 宜昌 443002)

【目的】 建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyceslavendularectus)gCLA4的遗传转化体系，为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】 以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒，EscherichiacoliET12567(pUZ8002，pSET152)为供体，淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验，并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】 成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中，明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素；链霉菌gCLA4孢子50 ℃热激时转化效率较高，接合效率在16，18，20 h下没有明显差异，MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高，接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】 建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。

生防链霉菌gCLA4菌株；接合转移；遗传转化；质粒pSET152

淡紫灰链霉菌gCLA4(Streptomyceslavendularectus,GenBank登录号为EF469608,菌种保藏号为GCMCC 2131)是旱区作物逆境生物学国家重点实验室分离自黄瓜叶片的一株拮抗菌，该菌株及其发酵液对番茄早疫病菌(Alternariasolani)、辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiotum)、苹果树腐烂病菌(Valsamali)等多种重要的植物病原菌均有很强的抑制作用，有良好的生防应用潜力[1]。目前对生防链霉菌gCLA4的研究仅限于对其发酵条件的优化及活性物质的初步研究[2]等方面，对其生防机理的分子机制涉及不多。旱区作物逆境生物学国家重点实验室已经对生防链霉菌gCLA4进行了全基因组测序，为了进一步对其中一些功能基因进行研究，建立简单、高效的gCLA4遗传转化体系就显得非常必要[3]。

链霉菌中常用的导入外源遗传物质的方法有PEG介导的原生质体转化法、接合转移法和电穿孔法。但不同的菌株因其特性不同，转化方法差别也很大[4]。自从Mazodier等[5]通过接合转移法成功将质粒由大肠杆菌转入变铅青链霉菌后，接合转移法作为一种非常有效的链霉菌基因转移方法，近年来得到了广泛应用，如福司曲星(Fostriecin)产生菌(Streptomycespulveraces)[6]、武夷菌素产生菌不吸水链霉菌(Strepomycesahygroscopicusvar.wuyiensis)[7]和Xinaomycins产生菌诺尔斯链霉菌(Streptomycesnoursei)[8]等链霉菌遗传转化系统的构建，淀粉酶产色链霉菌(Streptomycesdiastatochromogenes)1628接合转移体系的构建[9]，谷氨酰胺转氨酶产生菌(Streptomycesmobaraensis)属间接合转移体系的构建[10]等。pSET152是一种整合型的质粒，具有安普霉素抗性基因，可借助于自身所携带的噬菌体φC31整合酶基因，和attP位点与链霉菌染色体上的特定重组位点attB结合，从而整合到链霉菌染色体上，是研究链霉菌基因接合转移方法时常用的质粒[11]。

本研究采用接合转移法建立外源基因转入生防淡紫灰链霉菌gCLA4的遗传转化体系并进行优化，是首次将外源基因导入该链霉菌中，因此对采用链霉菌gCLA4进行基因遗传操作进而研究其抗病的分子机制有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株及质粒淡紫灰链霉菌gCLA4由旱区作物逆境生物学国家重点实验室从黄瓜叶片中分离并保存。大肠杆菌EscherichiacoliET12567(pUZ8002)为去甲基化菌株[12]。pSET152质粒为大肠杆菌-链霉菌穿梭型整合质粒，具有安普霉素抗性基因aac(3) Ⅳ、pUC18复制子、接合转移起点oriT及噬菌体φC31的整合酶基因int和整合位点attP[11]。

1.1.2培养基及抗生素淡紫灰链霉菌gCLA4产孢培养基为高氏一号，液体培养基为TSB[13]；接合转移培养基分别采用MS、高氏一号、TSB、YD、R2YE；孢子预萌发培养基采用2×YT；筛选转化子培养基选用高氏一号、2CMY、YD、YMS，上述培养基的配制参照链霉菌遗传操作手册[14]。大肠杆菌培养基为LB[13]。抗生素包括氯霉素(Cml)、卡那霉素(Kan)、安普霉素(Apr)、萘啶酮酸(Nal)、四环素(Tet)和潮霉素(Hyg)。

1.2方法

1.2.1质粒及链霉菌基因组DNA的提取大肠杆菌质粒提取基本操作参见文献[15]。链霉菌总DNA提取方法参照链霉菌遗传操作手册[14]。

1.2.2抗生素抗性检测选取安普霉素、卡那霉素、四环素、潮霉素、萘啶酮酸5种抗生素，分别加入2CMY培养基中，每种抗生素终质量浓度为0，1.0，2.0，5.0，10.0，15.0，20.0 mg/L。划线接种野生型gCLA4，28 ℃黑暗培养8 d后观察结果。

1.2.3大肠杆菌和链霉菌gCLA4之间的接合转移将整合型质粒pSET152用热激法[15]转入EscherichiacoliET12567(pUZ8002)中，得到供体菌株EscherichiacoliET12567(pUZ8002，pSET152)。挑取单菌落，接种于3 mL含有安普霉素50 mg/L和卡那霉素50 mg/L以及氯霉素30 mg/L的 LB液体培养基中，37 ℃培养过夜后，按1∶100的体积比转接到30 mL含有相同抗生素的新鲜LB液体培养基中，37 ℃培养至OD600为0.4～0.6。离心收集菌体，用等体积不含抗生素的新鲜LB培养基洗涤菌体3次，将菌体悬浮于1 mL不含抗生素的 LB培养基中备用。

在长满链霉菌gCLA4孢子的高氏一号平板上加10 mL无菌水，用接种环刮下孢子后将孢子粗悬液倒入离心管中，涡旋振荡打散孢子后离心倒掉上清液，然后将菌体悬浮于1 mL 2×YT培养基中，热激10 min后于28 ℃、150 r/min摇床中预萌发2.5 h。

将备用的大肠杆菌和预萌发好的链霉菌gCLA4孢子悬液按1∶1体积比混合，每200 μL滴在孔径为0.22 μm的微孔滤膜(放置于接合培养基表面)上。28 ℃培养16～20 h后，用400 μL无菌水将微孔滤膜上的菌体洗涤到含有抗生素的筛选培养基上，28 ℃培养3～4 d后长出接合子。

1.2.4接合转移体系的优化接合转移过程中热激温度设置45，50，55 ℃ 3个处理，时间设置16，18，20 h 3个时间段，接合培养基选择R2YE、MS、TSB、YD和高氏一号5种，筛选转化子的抗性培养基选择高氏一号、2CMY、YD、YMS 4种(每种培养基中含萘啶酮酸20 mg/L和安普霉素10 mg/L)。所有试验中供体大肠杆菌细胞数量保持108不变，链霉菌gCLA4菌丝体量或孢子量从105～108以10倍递增。以肉眼可分辨的转化子为准，接合效率用接合子数除以菌丝体或孢子量表示，取3次重复的平均值。

1.2.5接合转化子的PCR扩增反应验证用含有10 mg/L安普霉素的2CMY培养基培养接合转化子，打取菌饼接种于含有10 mg/L安普霉素的TSB液体培养基中培养48 h，收集菌丝体，提取总DNA作为模板。以野生型链霉菌gCLA4的总DNA为阴性对照，以pSET152质粒为阳性对照，同时设清水对照。根据安普霉素抗性基因设计1对引物，扩增大小为750 bp左右的片段。PCR条件反应程序为：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃10 min。引物为AMF(5′-GGTTCATGTGCAGCTCCATCAGC-3′)和AMR(5′-ATGAGCTCAGCCAATCGACTGG-3′)[16]。

2　结果与分析

2.1生防链霉菌gCLA4接合转移体系的建立和优化

2.1.1对抗生素的敏感性为了确定能用于链霉菌gCLA4遗传操作的抗生素选择标记，分别检测了生防链霉菌gCLA4对安普霉素、四环素、卡那霉素、萘啶酮酸、潮霉素5种抗生素的抗性水平。由表1结果可知，生防链霉菌gCLA4对安普霉素和四环素比较敏感，在含2.0 mg/L安普霉素或5.0 mg/L四环素的平板上生长非常缓慢；对潮霉素、卡那霉素和萘啶酮酸不敏感，在含20.0 mg/L卡那霉素、潮霉素和萘啶酮酸的平板上依然可以生长，表明安普霉素或四环素的抗性基因可以用于链霉菌gCLA4遗传操作的选择标记。

表 1　生防链霉菌gCLA4对不同抗生素的敏感性Table 1　Sensitivity of Streptomyces lavendularectus gCLA4 to antibiotics

注：++.正常生长；+.缓慢生长；-.不生长。

Note:++.Normal growth；+.Slow growth；-.No growth.

2.1.2热激温度对接合效率的影响热激处理的目的是促进孢子萌发，孢子萌发是影响接合效率的一个重要因素。试验中设置45，50，55 ℃ 3个温度处理，每个温度热激10 min，然后在28 ℃、150 r/min 的摇床中预萌发2.5 h，结果见表2。

表 2　热激温度对生防链霉菌gCLA4接合效率的影响Table 2　Influence of heat temperature on conjugation frequency of Streptomyces lavendularectus gCLA4

表2显示，在50 ℃ 热激10 min、28 ℃预萌发2.5 h条件下接合效率最高，为2.46×10-6。当热激温度为45 ℃时接合效率较低，而当温度为55 ℃时没有接合转化子出现。因此确定孢子萌发条件为50 ℃热激10 min后再28 ℃预萌发2.5 h。

2.1.3接合转移时间对接合效率的影响试验结果显示，接合转移时间为16，18，20 h时，接合效率没有明显变化。

2.1.4接合转移培养基对接合效率的影响选择R2YE、MS、TSB、YD和高氏一号5种不同的接合转移培养基，分别直接涂布平板，使用0.22 μm微孔滤膜进行接合。结果表明：在MS培养基上使用 0.22 μm微孔滤膜进行接合转移的效率为10-7～10-6，而在其他培养基上得到的接合转化子很少甚至得不到接合子。因此，选择MS培养基作为链霉菌gCLA4接合转移的最适培养基。

2.1.5筛选转化子培养基对接合效率的影响将0.22 μm微孔滤膜上的混合菌体洗涤到筛选培养基上时，选择高氏一号、2CMY、YD、YMS 4种培养基，每种培养基中抗生素为萘啶酮酸(20 mg/L)、安普霉素(10 mg/L)。结果显示，链霉菌gCLA4在高氏一号抗性平板上的接合效率为10-7～10-6，而在2CMY、YD、YMS 3种抗性培养基上均出现了生长非常旺盛、与大肠杆菌混在一起且难以分辨的单菌落。因此，选择含有萘啶酮酸20 mg/L、安普霉素10 mg/L的高氏一号抗性培养基作为筛选转化子的培养基。

2.2生防链霉菌gCLA4接合子的PCR鉴定及稳定性检测

pSET152属于基因整合型质粒，转入链霉菌gCLA4后，不能单独存在于细胞质中，而是整合到菌株的基因组上[13]。随机挑选20个生防链霉菌gCLA4接合子，提取其基因组DNA，用安普霉素的抗性基因引物分别扩增。PCR检测结果(图1)显示，转化子及阳性对照pSET152质粒均扩增出750 bp左右的条带，而野生型链霉菌gCLA4 DNA没有扩增出目的片段，由此证实pSET152质粒已成功转入到链霉菌gCLA4中。

图 1　生防链霉菌gCLA4接合转化子的PCR扩增 W.清水对照；1.质粒pSET152；2～21.接合转化子；22.野生型链霉菌gCLA4；M.DNA MarkerFig.1　PCR identification of exconjugants of Streptomyces lavendularectus gCLA4 W.Water control;1.Plasmid pSET152;2-21.Exconjugants;22.Wild Streptomycete gCLA4;M.DNA Marker

为了检测质粒pSET152在接合转化子中的稳定性，将接合转化子在不含安普霉素的2CMY平板上连续转接5次后，随机挑取100个单菌落转接到含有安普霉素的2CMY平板上，没有发现抗性消失的菌落；同时随机挑选10个单菌落，经PCR验证发现，与接合转化子验证结果一致；表明质粒pSET152能在链霉菌gCLA4中稳定遗传。

3　讨论与结论

链霉菌是一类具有重要经济价值的革兰氏阳性菌，其(G+C)含量一般高达70%以上，能产生多种抗生素和生物活性物质。不同链霉菌菌株之间差异很大，因而转化方法及转化效率也不同[4]。

本试验中，50 ℃热激10 min时生防链霉菌gCLA4的接合效率最高，45 ℃时接合效率较低，55 ℃时则没有长出接合子；接合转移时间为16，18，20 h时接合效率没有明显差异；在MS培养基上使用0.22 μm微孔滤膜的接合效率最高，因为0.22 μm微孔滤膜可以使大肠杆菌与链霉菌充分紧密接触，菌体可以透过滤膜吸收必要的营养物质，维持其生长，从而提高接合效率；筛选接合转化子时采用含有萘啶酮酸20 mg/L、安普霉素10 mg/L的高氏一号抗性培养基效果最好，因为含有抗生素的平板相对于抗生素无菌水覆盖平板而言，用前者筛选接合转化子的结果更可靠，假阳性相对较少，但含有抗生素培养基的种类根据不同的种属有较大的差异，需要根据菌株选择优化。

建立生防链霉菌gCLA4遗传操作体系是对其遗传调控进行分子水平研究的必要前提；同时，遗传操作体系的建立使得有目的地定向改造基因、提高基因表达水平以及改造菌株生产能力、依靠基因重组生成新的化合物成为了可能，为其生防分子机制研究奠定了基础。

[1]涂璇,黄丽丽,高小宁,等.黄瓜内生放线菌的分离、筛选及其活性菌株鉴定 [J].植物病理学报,2008，38(3)：244-251.

Tu X,Huang L L,Gao X N,et al.Endophytic actinomycetes of cucumber：isolation,antagonistic activity and identification [J].Acta Phytopathologica Sinica,2008,38(3):244-251.

[2]申哲，黄丽丽，涂璇，等.植物内生放线菌活性物质防治猕猴桃溃疡病 [J].中国生物防治，2008，24(4)：329-334.

Shen Z,Huang L L,Tu X,et al.Control effect of kiwifruit bacterial canker by active metabolites from plant endophytic actinomycetes [J].Chinese Journal of Biological Control,2008,24(4):329-334.

[3]Bilyk B,Weber S,Myronovskyi M,et al.Invivorandom mutagenesis ofStreptomycetesusing mariner-based transposonHimar1 [J].Applied Microbiology and Biotechnology,2013,97(1):351-359.

[4]吴胜，夏焕章.链霉菌基因转移的方法 [J].生物工程进展，2002，22(1)：91-94.

Wu S,Xia H Z.The methods of gene transfer inStreptomyces[J].Progress in Biotechnology,2002,22(1):91-94.

[5]Mazodier P,Petter R,Thompson C.Intergeneric conjugation betweenEscherichiacoliandStreptomycesspecies [J].Journal of Bacteriology,1989,171(6):3583-3585.

[6]刘雪娇，牛铭山，邱荣国，等.Fostriecin 产生菌Streptomycespulveraceus遗传转化体系的建立与优化 [J].微生物学通报，2012，39(3)：371-377.

Liu X J,Niu M S,Qiu R G，et al.Establishment and optimization of the conjugal transfer system of Fostriecin producerStreptomycespulveraceus[J].Microbiology China,2012,39(3):371-377.

[7]杨振娟，孙蕾，武哲，等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建 [J].生物技术通报，2012 (10)：193-198.

Yang Z J,Sun L,Wu Z,et al.Construction of the conjual yransfer system ofStreptomycesahygroscopicusvar.wuyiensisCK-15 [J].Biotechnology Bulletin,2012(10):193-198.

[8]Sun F H,Luo D,Shu D,et al.Development of an intergeneric conjugal transfer system for Xinaomycins-producingStreptomycesnourseiXinao-4 [J].International Journal of Molecular Sciences,2014,15(7):12217-12230.

[9]Ma Z,Liu J,Bechthold A,et al.Development of intergeneric co-njugal gene transfer system inStreptomycesdiastatochromogenes1628 and its application for improvement of toyocamycin production [J].Current Microbiology,2014,68(2):180-185.

[10]Park J Y,Choi S U.Construction of intergeneric conjugal transfer for molecular genetic studies ofStreptomycesmobaraensisproducing transglutaminase [J].African Journal of Biotechnology,2014,13(13):1462-1466.

[11]Bierman M,Logan R,O’brien K,et al.Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA fromEscherichiacolitoStreptomycesspp. [J].Gene,1992,116(1):43-49.

[12]Choi S U,Lee C K,Hwang Y I,et al.Intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA fromEscherichiacolitoKitasatosporasetae,a bafilomycin B1 producer [J].Archives of Microbiology,2004,181(4):294-298.

[13]咸洪泉.微生物学实验教程 [M].北京:高等教育出版社,2010：2-6.

Xian H Q．Experimental technique of microbiology [M].Beijing:Higher Education Press,2010：2-6.

[14]Kieser T,Bibb M J,Buttner M J,et al.PracticalStreptomycesgenetics [M].Norwich:The John In-nes Foundation,2000.

[15]奥斯伯 F M，布伦特 R,金斯顿 R E,等.精编分子生物学实验指南 [M].5版.北京：科学出版社,2002：26-27.

Ausubel F M,Brent R,Kinston R E,et al.Short protocols in molecular biology [M].5th ed.Beijing:Science Press,2002：26-27.

[16]Petzke L,Luzhetskyy A.InvivoTn5-based transposon mutagenesis ofStreptomycetes[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2009,83(5):979-986.

Establishment and optimization of genetic transformation system for bio-controlStreptomyceslavendularectusgCLA4

XU Mengmeng1a,2,ZHANG Hong1c,2,HE Jiao1a,2,TU Xuan3,YAN Xia1a,2,HUANG Lili1b,2

(1 aCollegeofLifeSciences,bCollegeofPlantProtection,cCollegeofScience,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2StateKeyLaboratoryofCropStressBiologyforAridAreas,Yangling,Shaanxi712100,China;3CollegeofBiologicalandPharmaceutical,ChinaThreeGorgesUniversity,Yichang,Hubei443002,China)

【Objective】 The genetic transformation system of bio-controlStreptomyceslavendularectusgCLA4 was established for modifying gene and raising the level of gene expression and laying foundation for research of its bio-control mechanisms.【Method】 Intergeneric genetic transfer system was based upon integrative plasmid pSET152 with apramycin resistance gene from donorEscherichiacoliET12567/pUZ8002 toS.lavendularectusgCLA4.Various influencing factors including culture medium,heat temperature,time of conjugation and the medium for screening were optimized.【Result】 The plasmid was transferred intoS.lavendularectusgCLA4 and the best conditions of conjugation were determined.Apramycin and tetracycline could be used to screen the transformation of gCLA4.When the gCLA4 spores were heat-shocked at 50 ℃,the conjugation efficiency was the highest.There was no difference in conjugation among different times 16,18,and 20 h.MS medium was the preferred medium for conjugation and exconjuants coating to the GAUZE’s medium No.1 with antibiotic was the best.【Conclusion】 The optimal genetic transformation system of bio-controlS.lavendularectusgCLA4 was established.

StreptomyceslavendularectusgCLA4；conjugal transfer；genetic transformation;pSET152

时间:2016-09-0709:03DOI：10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.10.017

2015-03-11

国家自然科学基金项目(31101476，31171796)；陕西省科学技术研究发展计划项目(2013K01-45)；杨凌示范区科技计划项目(2014NY-41)

徐萌萌(1988-)，女，山东即墨人，在读硕士，主要从事微生物资源与利用研究。E-mail：woshixiaxue@126.com

颜霞(1974-)，女，山东宁阳人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事微生物资源利用研究。

E-mail：yanxia@nwsuaf.edu.cn

Q933

A

1671-9387(2016)10-0121-05

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20160907.0903.034.html