高迁移率蛋白A2在睾丸肿瘤组织中的表达及临床意义

董超雄 杨柳平

【摘要】目的：探讨HMGA2在睾丸癌组织中的表达及意义。方法：运用荧光定量PCR（Q-PCR）和Western blot 方法检测HMGA2mRNA和蛋白在17例睾丸肿瘤和15例正常睾丸组织中的表达差异、免疫组织化学（IHC）方法检测HMGA2蛋白在44例睾丸肿瘤，30例良性组织芯片中的表达差异。结果：HMGA2mRNA表达在癌组织中明显高于良性组织：（9.09±2.95） vs. （3.86±1.66）， P=0.036、HMGA2蛋白在癌肿组织中的表达亦显著高于良性组织：（9.27±2.91） vs. （4.66±1.62）， P=0.037。 HMGA2蛋白的表达高低和睾丸肿瘤的临床分期及肿瘤大小密切相关，P<0.05。结论：HMGA2在睾丸肿瘤组织中上调表达并和肿瘤进展相关，有望成为睾丸肿瘤治疗的分子靶点。

【关键词】高迁移率蛋白A2；睾丸肿瘤；肿瘤进展

Up-regulated expression of HMGA2 in testicular cancer tissue and its clinical significanceDONG Chaoxiong， YANG Liuping. Department of Urology Surgery， Guangzhou 8th Peoples Hospital， Guangzhou 510440， Guangdong， China

【Abstract】Objectives： To investigate the expression and significance of HMGA2 in testicular cancer tissue. Methods： Using the fluorescent quantitative PCR （Q - PCR） and Western blot methods to detect HMGA2mRNA and protein in 17 cases of testicular tumors and 15 cases of normal testicular tissue， immunohistochemical （IHC） method to detect HMGA2 protein in 44 cases of testicular tumors and 30 cases of benign tissue by microarray. Results： HMGA2mRNA expression in cancerous tissue was significantly higher than that of benign group （9.09 ±2.95 VS 3.86± 1.66， P = 0.036）； HMGA2 protein expression in tumor tissue was significantly higher than that of benign organization （9.27±2.91 VS 4.66 ± 1.62， P = 0.037）. HMGA2 protein expression levels in testicular tumors were associated with clinical staging and the tumor size （P<0.05）. Conclusion： Up-expressed of HMGA2 in testicular cancer is associated with tumor progression and size， which is expected to become the molecular targets of testicular tumor treatment.

【Key words】HMGA2； Testicular tumors； Tumor progression

【中图分类号】R679+.22；R737.21【文献标志码】A

睾丸肿瘤是青年男性最常见的恶性实体肿瘤，随着肿瘤综合治疗的进展，睾丸癌的治愈率也得到了很大程度的提高。但对于临床进展期及转移性肿瘤，临床治疗效果仍旧较差，寻找合适的肿瘤进展期肿瘤标记物以及如何评估患者的预后风险是临床上亟待解决的问题。

高迁移率蛋白A2（HMGA2）是在肿瘤中广泛表达的蛋白之一，其表达异常与人类多肿瘤的发生、发展及预后相关。目前HMGA2与睾丸肿瘤组织的相关性国内较少研究，我们在这方面做了一定研究，报道如下。

1材料和方法

1.1材料

收集近5年来医院就诊的17例睾丸肿瘤活检或者手术组织标本以及15例正常睾丸活检组织标本用于Q-PCR及WB实验，其中肿瘤患者均未接受治疗，初次确诊为睾丸肿瘤，病理类型不限，所有标本均经过最后的病理确认。组织来源取材时候均向患者说明，并签署知情同意书。免疫组化（IHC）组织芯片标本包括44例睾丸肿瘤标本（病理及临床分期不限）及30例良性对照标本。

主要试剂及仪器：主要试剂为Trizol试剂盒、逆转录试剂盒均购自上海捷瑞生物工程有限公司（Generay， Lot No.1382737），2×Taq PCR Master Mix购自北京天根生化科技有限公司（德国QIAGEN，Lot No.148049845）， HMGA2基因及内参GAPDH基因PCR引物采用Primer 5.0软件设计、上海英骏生物公司合成。主要仪器Image Quant 300紫外凝胶成像仪（GE）、紫外分光光度计（Ependofe）、Real-time PCR仪（BIORAD， IQ5）、兔抗人HMGA2多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，SP试剂盒、DAB显色试剂盒均购自福州迈新生物科技公司。

1.2方法

1.2.1荧光定量PCR检测HMGA2mRNA的表达差异GenBank上查找目的基因mRNA序列，在CDS区设计特异性引物。GAPDH：F： 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，R： 5-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3。HMGA2：F： 5-CGAAAGGTGCTGGGCAGCTCCGG-3， R： 5-CCATTTCCTAGGTCTGCCTCTTG-3。反应条件：5×SYBR GreenⅠPCR buffer 10μL，上游引物F（10pmol/μL）和下游引物R（10pmol/μL）各1μL，dNTPs（10mM）1μL，Taq酶（3U/μL）1μL，ddH2O 31μL。反应条件为：95℃预变性5min，然后94℃40s，58℃退火40s，72℃45s，共40个循环。最后采用相对定量方法统计实验结果。

1.2.2HMGA2蛋白表达定量检测样本加3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOP buffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心。SDS-PAGE电泳，PVDF转膜，HMGA2及GAPDH抗体浓度均为1：400，HRP标记的抗IgG抗体（1：30000）的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育1h后发光，显影，图象分析。

1.2.3IHC检测HMGA2表达情况 免疫组化按照常规SP法试剂盒要求操作，多克隆抗体HMGA2工作浓度为1：200。，DAB试剂盒显色，苏木素复染胞核，以PBS 替代一抗作为阴性对照。结果判断：观察10个具有代表性的显微镜视野并确定阳性染色部位和阳性染色细胞的数量。阳性染色细胞百分比得分为：0分 （小于5%）， 1分 （5%～15%），2分 （15%～50%），3分（>50%）。染色强度评分：0分（不着色0），1分（淡黄色+），2分（深黄色++），3分（棕褐色染色+++）。总的免疫组化得分为阳性染色细胞百分比得分+染色强度得分。5分以上为高表达。

1.3统计学处理

使用SPSS17.0软件进行数据统计。正态分布的计量资料数据以（±s）表示，采用Wilcoxon秩和检验分析HMGA2蛋白在癌和良性组织之中IHC表达强度差异情况；Pearson χ2检验分析HMGA2蛋白在癌组织中的免疫组化评分与患者临床病理参数之间的关系。所有统计资料P<0.05认为有统计学意义。

2实验结果

2.1HMGA2mRNA在睾丸肿瘤组织中的表达水平

以GAPDH为参照基因，Q-PCR结果显示HMGA2mRNA表达水平在睾丸肿瘤组织中明显高于良性组织）9.09±2.95） vs. （3.86±1.66），P=0.036。见图1A。

2.2HMGA2蛋白在癌组织中的表达

在17例肿瘤组织和15例良性组织中，Western blot实验证实HMGA2蛋白在癌组织中的表达均高于对应的良性组织（9.27±2.91） vs. （4.66±1.62），P=0.037。见图1B、图1C。

2.3HMGA2蛋白主要表达定位在细胞胞质

免疫组化检测发现HMGA2蛋白主要表达定位在细胞胞质，阳性信号为棕黄色。癌组织和良性组织中均有表达（见图2）。根据Wilcoxon秩和检验比较HMGA2蛋白在睾丸癌和良性组织中染色强度变化，各个评分区间统计学差异明显（P<0.001），说明HMGA2在癌组织中的评分高于良性组织。把44例睾丸癌组织标本根据染色评分分为≤4分组（低表达），≥5分组（高表达）两组，我们发现：HMGA2蛋白表达情况和患者年龄、婚姻与否、病理类型、转移组间无统计学差异，和肿瘤临床分期（χ2=6.070，P=0.014），肿瘤大小（χ2=5.698，P=0.017）组间差异明显。见表1。

3讨论

人类HMGA2基因[1，2] （HMGI-C基因），位于染色体12q-15区[3-5]，由5个外显子和4个内含子组成，其中外显子1～3编码3个DNA结合区域，外显子4编码DNA结合区域和酸性羧基末端之间的间隔区，外显子5则编码酸性羧基末端。HMGA2目前认为是一种结构转录因子，可以对大量基因的转录和活化进行调节[6]，特别是那些与细胞增殖和凋亡相关的基因。所以说HMGA2在肿瘤的发生、侵袭和转移过程中发挥着重要作用[7，8]。HMGA2的致癌机制目前尚不明确[9]，可能的原因是其异常激活、调控与肿瘤形成和进展的多种基因协同作用所致。Seville [10]指出：HMGA2可调控转录因子E2F1，进而抑制细胞分裂进入S期。Fedele[11] 也指出HMGA2的过表达进而激活E2F1的活性对肿瘤的形成是至关重要的[12]，而E2F1作为一类重要的转录因子家族成员，已经明确和大多肿瘤的发生和进展相关。表1HMGA2蛋白在睾丸肿瘤组织中的表达与患者临床病理之间的相关联系特征nHMGA2（n= 44）低表达高表达χ2 P年龄<40206140.0560.813≥4024816病理类型精原细胞257180.3890.533非精原19712临床分期

目前已经发现HMGA2的过表达与多种肿瘤相关，包括乳腺癌[13]、胰腺癌[14]和非小细胞肺癌[15] ，同时HMGA2的异常表达和这些肿瘤的预后也密切相关，这和本研究结果类似。我们的结果发现HMGA2在睾丸组织中明显高表达，并且HMGA2的表达强度和肿瘤的临床分期及肿瘤大小明显相关，说明HMGA2蛋白可促进癌肿细胞的增殖或者是减弱癌细胞的凋亡。Pentimalli[16] 指出HMGA2的致癌性也和其过表达破坏DNA的修复能力有关。而比较明确的是机体DNA自身的修复系统是抵抗肿瘤形成最好的防御，HMGA2与DNA损害细胞应答的关键因子ATM激酶有关。它与激活型的ATM相似，从而影响其DNA修复功能。但是，我们的结果并没有发现HMGA2蛋白的表达强度和癌肿的转移以及病理类型相关，这和一些学者的研究结果有出入。可能的原因是我们的实验样本数目较少，另外并没有患者的确切生存资料供分析。当然具体深层次的分子机制还有待进一步研究。

本研究揭示出HMGA2在人睾丸组织中有较强的表达，并与肿瘤临床分期密切相关，对睾丸癌的预后判断具有重要意义，有望作为睾丸癌进展及预后判断的指标，并有可能作为睾丸癌治疗干预的新靶点。参考文献

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