纳米包装材料对金针菇木质化及相关酶活性的影响

方东路，常诗洁，赵立艳，安辛欣，胡秋辉，杨文建,

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023）

纳米包装材料对金针菇木质化及相关酶活性的影响

方东路1，常诗洁1，赵立艳1，安辛欣1，胡秋辉2，杨文建2,*

（1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心，江苏 南京 210023）

添加纳米银、纳米二氧化钛、凹凸棒土和纳米二氧化硅等材料制备一种纳米聚乙烯包装袋。跟踪检测4 ℃、相对湿度90%～95%贮藏过程中金针菇的菌柄最大剪切力、质量损失率、可溶性蛋白含量、木质素含量、苯丙氨酸解氨酶活性、肉桂醇脱氢酶活性、过氧化物酶活性和细胞微观结构的变化，分析纳米材料和普通聚乙烯材料包装对金针菇木质化劣变的影响。贮藏14 d后，纳米包装袋内金针菇菌柄最大剪切力、质量损失率和苯丙氨酸解氨酶、肉桂醇脱氢酶、过氧化物酶活性分别为1.191 kg、0.51%和20.72、41.23、10.09 U/mg，显著低于普通PE包装组（P＜0.05）；另一方面，纳米包装金针菇样品中的木质素含量相比最初仅增加4.7%，而普通PE包装组木质素含量则增加了14.2%。纳米包装袋能够有效抑制贮藏期间金针菇木质素的积累及相关酶活性的上升，很好地保持金针菇贮藏品质，延长贮藏时间。

金针菇；纳米材料；保鲜；木质化；货架期

金针菇（Flammulina velutipes （Fr.） Sing.），又名构菇、朴菇、毛柄金钱菌等，是我国六大食用菌类之一，2012年我国金针菇产量已达240.1万 t［1］。新鲜的金针菇呈淡黄色或白色，柄脆、菌盖滑嫩、味美适口、营养丰富，具有多种食疗保健功能，深受消费者的喜爱。但由于金针菇子实体含水量高、质地脆嫩，采后呼吸和新陈代谢旺盛，使得金针菇子实体非常容易出现菇失水、柄木质化、开伞、萎蔫、褐变、甚至腐烂等品质劣变现象，常温条件下仅能保存2～3 d，4 ℃贮藏保质期也仅保存7 d左右［2］。金针菇的贮藏特性成为制约金针菇产业发展的一个重要问题。因此，针对以上问题，研发一种既有利于金针菇等食用菌贮藏且使用便捷的保鲜技术手段，对延长金针菇货架期、减少企业生产销售环节的损失具有十分重要的研究意义和应用前景。

目前来看，食用菌的保鲜方法主要集中在涂膜保鲜［3］、气调保鲜［4］、臭氧保鲜［5］、辐照处理［6］等。不同保藏方法具有不同的优势和限制，在实际企业的生产销售过程中应用较多的是冷藏结合自发性气调的方式。纳米级的包装材料由于其特殊的组成和结构，具备了传统包装材料所不具备的独特性能［7］，由于纳米材料良好的抗菌性、乙烯消除特性、阻湿性等［8-9］，它更适合鲜活农产品的贮藏保鲜，近年来越来越受到国内外研究的关注［10-11］。Zhao Liyan等［12］利用纳米材料保藏绿茶，发现纳米包材可以减少绿茶保藏过程中的氨基酸、茶多酚、叶绿素和维生素的流失。Hu Qiuhui等［13］的研究发现纳米包材可以显著提高猕猴桃冷藏中的营养品质和抗氧化酶的活性，并将贮藏期延长至42 d。类似的实验结果在草莓贮藏保鲜中也得到了验证［14］。另一方面，有研究表明食用菌的木质化与其硬度、成熟度与褐变度等多种品质变化密切相关［15］。但国内外木质化劣变的研究主要集中在枇杷果、竹笋、芦笋、菜心、胡萝卜、番荔枝等几个品种上［16-19］，目前关于金针菇采后的木质化劣变的研究鲜见报道。在前期纳米保鲜实验的基础上，进一步改良纳米材料配方工艺，提高其阻隔性和机械强度等功能特性，并通过研究纳米材料对苯丙烷类代谢途径以及木质素积累的影响，进而分析纳米材料对金针菇保鲜作用的原因，为纳米保鲜技术的应用和推广打下理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

实验用金针菇（品种F3-46） 江苏天丰生物科技有限公司。实验于2016年5月3到18日在南京农业大学食品科技学院实验室进行。

纳米银、纳米二氧化钛、纳米二氧化硅、凹凸棒土南京海泰纳米材料有限公司；牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、巯基乙醇、聚乙二醇 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2仪器与设备

ELX800酶标仪 美国Bio-Tek公司；SF-200型塑料封接机 江苏连云港微波电器厂；TA. XT2i质构仪 英国Stable Micro Systems公司；Allegra 64R冷冻离心机 美国Beckman公司；TSY-T1透湿性测试仪、BTY-B1透气性测试仪 上海华岩仪器设备有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司；H-7650透射电镜 日本Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1包装袋制备

纳米包装膜（厚度为40 μm）的制备参考李志啸等［20］的加工工艺。纳米原料按照纳米银-纳米二氧化钛-纳米二氧化硅-凹凸棒土质量比6∶7∶2∶5进行混合制粒得到纳米复合粉体，然后按照纳米混合粉体15%、聚乙烯塑料粒子68%、偶联剂2%、分散剂10%、润滑剂5%进行混匀制粒得到纳米母粒，最后将纳米母粒7.5%、复合塑料粒子84.5%和防雾剂母粒7.5%混匀吹制得到纳米包装膜，之后剪裁为25 cm×25 cm大小的包装袋，应用于后面的实验。按照同样的工艺制备不含纳米粒子相同厚度和规格的普通PE塑料薄膜包装袋作为对照。

1.3.2样品处理

金针菇在工厂采后用泡沫盒包装保温完毕，1 h内运至实验室冷库，在4 ℃条件下预冷24 h，之后挑选出金针菇子实体完整、无褐变、未开伞、无病虫害、无机械伤、菌柄长度在10～15 cm的金针菇。接着进行普通PE包装袋和纳米包装袋2 种包装处理。每袋装金针菇250 g，两种包装组各24 袋，置4 ℃相对湿度90%～95%冷藏14 d，每隔2 d拆袋取样按照要求进行各项指标的测定。

1.3.3纳米包装袋物理性能测定

物理性能有拉伸强度、断裂标称应变、直角撕裂强度、透光率、透氧率、透二氧化碳率和透湿率，测定方法分别依据GB/T 1038—2000《塑料薄膜和薄片气体透过性试验方法：压差法》、GB/T 21529—2008《塑料薄膜和薄片水蒸气透过率的测定：电解传感器法》和GB/T 1040.3—2006《塑料：拉伸性能的测定》。

1.3.4菌柄剪切力测定

参考黄艳等［21］的方法，使用TA. XT2i质构仪，选择HDP/BSK探头，对每个金针菇样品菌柄中间部位分别进行切断测定。探头下行速率2.0 mm/s，下行距离30 mm，触发压力20 g。重复测定10 次，取平均值。

1.3.5质量损失率测定

采用称质量法测定质量损失率，计算如式（1）所示：

1.3.6可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝G-250（Bradford）法［22］，称取4 g金针菇样品，液氮研磨后加入36 mL磷酸缓冲液，混匀后4 000 r/min离心取上清液进行测定，计算如式（2）所示：

式中：C为标准蛋白当量/μg；VT为样品稀释总体积/mL；MF为样品鲜质量/g；VS为测定时样品加样量/mL。

1.3.7木质素含量测定

参照Bruce等［23］的方法进行木质素含量测定。称取l g金针菇样品，加入5 mL 95%乙醇溶液进行研磨，经3 000×g离心7 min后，沉淀物用95%乙醇溶液冲洗3 次，再用乙醇-正己烷（l∶2，V/V）冲洗3 次，收集沉淀物并干燥，干燥物溶于25%溴乙酰冰醋酸溶液中，在70 ℃恒温水浴中加塞保温30 min，然后加入0.9 mL 2 mol/L NaOH溶液终止反应，再加入5 mL冰醋酸和0.l mL 7.5 mol/L的羟胺盐酸，并用冰醋酸定容至10 mL，之后再1 000×g离心7 min，上清液在280 nm波长处测定吸光度，以每克鲜质量在280 nm波长处的吸光度表示木质素含量，测定3 次重复。

1.3.8苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonia-lyase，PAL）活性测定

PAL活性测定采用南京建成生物工程研究的试剂盒。在30 ℃条件下，每毫克组织蛋白在反应体系中每分钟吸光度变化0.1为1 个酶活力单位（U/mg）。

1.3.9肉桂醇脱氢酶（cinnamyl alcohol dehydrogenase，CAD）活性测定

参照Goffner等［24］方法，将样品进行液氮研磨，迅速称取液氮研磨后粉末1 g加入到1.5 mL离心管中，加入1 mL事先预冷的0.1 mmol/L pH 6.25的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS），PBS内含15 mmol/L巯基乙醇、2%聚乙二醇和0.1 g PVP。在4 ℃条件下18 000 r/min离心20 min，取上清液200 μL加入到800 μL含10 mmol/L NADP和5 mmol/L反式肉桂酸的反应液中，之后在37℃水浴锅中反应30 min，最后用1 mmol/L HCl溶液中止反应后，测定340 nm波长处的吸光度，以200 μL PBS加800 μL反应液为对照，实验测定3 次重复。1.3.10 过氧化物酶（peroxidase，POD）活性测定

采用南京建成生物工程研究所生产的相应试剂盒进行POD活性测定。每毫克组织蛋白1 min催化产生1 μg的底物的酶量定义为1 个POD活力单位（U/mg）。

1.3.11透射电镜观察

分别切取金针菇样品组织（2 mm×1 mm）于3.5%戊二醛中固定，0.1 mol/L pH 7.2的PBS冲洗，用1%锇二酸固定，0.1 mol/L PBS冲洗。用35%、45%、60%、70%、85%、95%和100%的乙醇溶液梯度洗脱，接着用环氧丙烷过渡，Spurr树脂浸透包埋，20 ℃聚合8 h后取出，修块，在超薄切片机上切片，用醋酸双氧铀-柠檬酸铅双染色，使用透射电镜进行观察拍照。

1.4数据处理

数据处理利用SAS 8.2软件进行方差分析和邓肯多重比较差异显著性检验。

2　结果与分析

2.1不同包装物理性能分析

表1　不同包装袋物理性能比较Table1　Physical properties of normal and nanocomposite-based packaging materials

从表1机械性能的比较可以看出，纳米膜的纵向拉伸强度、纵横向断裂标称应变和纵横向直角撕裂强度较普通保鲜膜均有所增强。另外，纳米膜的透二氧化碳率、透氧率和透湿率分别为13 064 cm3/（m2·d·0.1 MPa）、3 017.5 cm3/（m2·d·0.1 MPa）和6.34 g/（m2·d），均低于普通膜的各项指标。实验表明，添加纳米粒子的包装袋具有良好的机械性能以及对气体和水的阻隔性。

2.2纳米包装袋对金针菇菌柄最大剪切力的影响

图1　不同包装袋对金针菇菌柄最大剪切力的影响Fig.1　Effect of different packaging materials on maximum shearing force of Flammulina velutipes

如图1所示，在贮藏前6 d，纳米包装和普通PE包装的金针菇菌柄最大剪切力都随时间推移而增长，随后出现波动，并于第14天达到最高值。普通PE包装金针菇菌柄剪切力在第14天为1.306 kg，显著高于纳米组处理（1.191 kg）（P＜0.05）。实验表明普通PE包装金针菇在贮藏末期菌柄失水、纤维化现象较为严重，而纳米包材则较好地保持了菌柄质地和嫩度。

2.3纳米包装袋对金针菇质量损失率的影响

图2　不同包装袋对金针菇质量损失率的影响Fig.2　Effect of different packaging materials on weight loss of Flammulina velutipes

食用菌由于缺乏类似果皮的外保护组织结构，因此在贮藏期间除了新陈代谢消耗少量的物质外，质量损失率主要是由于水分散失而引起的品质劣变现象。从图2可以看出，纳米包装与普通包装的金针菇在4℃贮藏期间，其质量损失率均随着时间的延长而逐渐增大。但是从第4天以后，纳米包装组的金针菇质量损失率显著低于对照组（P＜0.05），贮藏14 d后纳米包装组质量损失率为0.51%。这种差异性的表现是由于不同包装材料其透湿性能不一致（表1），纳米包装材料具有相对较小的水分透过率，有效维持了包装袋内较高的湿度水平，进而抑制了金针菇子实体水分的进一步蒸发。

2.4纳米包装袋对金针菇可溶性蛋白含量的影响

图3　不同包装材料对金针菇可溶性蛋白含量的影响Fig.3　Effect of different packaging materials on soluble protein content of Flammulina velutipes

从表3可以看出，经过14 d的贮藏后，纳米包装组和普通PE包装组金针菇可溶性蛋白含量为6.327 mg/g和5.501 mg/g，分别比贮藏初期7.712 mg/g下降了17.9%和28.7%，达到显著水平（P＜0.05）。纳米包装材料在整个贮藏过程中对蛋白的保留效果都优于普通PE包装。

2.5纳米包装袋对金针菇木质素含量的影响

如图4所示，纳米包装处理可以抑制菇体内木质素的积累。对于纳米包装和普通PE包装两种处理，木质素的积累在第8天达到最大值。结果表明，纳米包装袋能够延缓木质素的积累，减小木质化劣变对金针菇品质的影响。

图4　不同包装材料对金针菇木质素含量的影响Fig.4　Effect of different packaging materials on lignin content of Flammulina velutipes

2.6纳米包装袋对金针菇PAL活性的影响

图5　不同包装材料对金针菇PAL活性的影响Fig.5　Effect of different packaging materials on PAL activity of Flammulina velutipes

从图5可以看出，普通PE包装的金针菇PAL活性一直高于纳米包装。纳米包装组和普通PE包装组PAL活性先升高后缓慢降低，并且均在贮藏第6天达到活性高峰，分别为23.467 U/mg和27.703 U/mg，贮藏14 d后纳米包装组PAL活性为20.72 U/mg。纳米包装可以显著降低贮藏期间金针菇PAL活性，延缓金针菇苯丙氨酸代谢的速率，进而调控木质素的合成途径。

2.7纳米包装袋对金针菇CAD活性的影响

图6　不同包装材料对金针菇CAD活性的影响Fig.6　Effect of different packaging materials on CAD activity of Flammulina velutipes

由图6可看出，两种包装处理组金针菇冷藏期间CAD活性变化趋势呈现同样的规律，即在贮藏前4 d CAD活性呈缓慢上升趋势，贮藏4 d后CAD活性急剧上升，并在第6天形成一个酶活的高峰，其值分别为90.23 U/mg（普通PE包装组）和70.14 U/mg（纳米包装组）。随后CAD活性呈下降趋势，贮藏14 d后纳米包装组CAD活性为41.23 U/mg。实验结果显示，纳米包装可以显著延缓冷藏金针菇CAD活性的上升。

2.8纳米包装袋对金针菇POD活性的影响

图7　不同包装材料对金针菇过POD活性的影响Fig.7　Effects of different packaging materials on POD activity of Flammulina velutipes

如图7所示，采后金针菇POD活性迅速上升，贮藏第2天达到高峰，普通包装组的样品POD活性达到44.78 U/mg，显著高于纳米包装组的26.39 U/mg（P＜0.05）。第4天后，两组的POD活性逐渐下降，两种包装间的POD活性差异不大，贮藏14 d后纳米包装组POD活性为10.09 U/mg。整个贮藏过程，纳米包装处理金针菇POD活性始终低于普通PE包装，并在前期阻止了POD活性高峰的出现，说明纳米包装可以抑制金针菇贮藏期POD活性的上升。

2.9透射电镜观察结果

图8　不同包装袋对金针菇细胞微观结构的影响Fig.8　Effects of different packaging materials on microscopic structure of Flammulina velutipes

如图8所示，贮藏14 d后，纳米包装金针菇细胞结构较为饱满，胞壁结构完整。而普通PE包装组金针菇在贮藏末期可以发现细胞形状变形严重，部分细胞出现裂解破裂，内溶物溶出。

3　讨 论

金针菇在采后贮运过程中，易发生失水、开伞、木质化劣变等现象，从而造成金针菇菌柄质地变硬而粗糙，严重降低其食用品质和经济价值［25］。研究表明，苯丙烷类代谢途径与果蔬采后贮藏过程中的木质化劣变密切相关［26］。苯丙烷类代谢途径首先通过PAL等关键酶将苯丙氨酸合成香豆素、黄酮醇等木质素单体化合物，进一步通过CAD和POD将木质素单体的氧化聚合成木质素大分子，从而促进木质素的合成和积累［27］。

根据前人研究报道，在贮运销售过程中，适当的包装处理可以为食用菌提供一个适宜的贮藏环境，进而可以实现减少机械损伤、减缓子实体的生理代谢活动、提高贮藏品质的效果［28-29］。本实验纳米包装袋中的金针菇维持着较低的最大剪切力值和质量损失率，说明纳米包装的环境适宜，金针菇失水、木质化等劣变现象不严重。金针菇在贮藏期间其硬度变化与其可溶性蛋白含量的变化呈正相关［30］，纳米包装处理的金针菇在贮藏末期保持了较高的可溶性蛋白含量，此结果与贮藏照片中反映出的纳米包装金针菇较好的质地相互佐证，这与单楠等［2］的研究结果一致，纳米材料结合自发性气调，可以显著保持贮藏产品的营养品质。同时，木质素合成过程中关键酶PAL、CAD和POD的活性，在纳米包装处理组中得到了明显的抑制，进而导致木质素在纳米处理金针菇中积累缓慢。所以相比于普通PE包装，纳米包装更有利于保持金针菇的质地。李志啸等［20］的研究结果同样发现，纳米包装处理可以减缓双孢菇中菇体细胞壁木质素和纤维素含量的增加，抑制双孢菇的褐变现象，提高其贮藏品质。

纳米材料因为其粒子具有较大的比表面积，所以该材料可以体现出一般尺度粒子所不具备的特殊性质，并开始在食品包装上逐渐推广应用［31］。有研究已经证明，材料中添加的纳米粒子可以氧化贮藏环境中的乙烯［32］，并抑制内源乙烯的产生［33］，从而延缓果实的成熟衰老。另外，纳米材料有很好的抑菌效果，杨燕婷等［34］研究发现添加纳米银、纳米二氧化钛等原料制备成的纳米材料可以显著降低黑曲霉孢子的发芽率。纳米材料的抑菌效果在Echegoyen等［35］的实验中也被证明。纳米二氧化硅由于其比表面积大、耐热性好，被广泛运用于包装材料中，在母粒制备过程中，纳米二氧化硅也可以作为纳米银粒子的吸附载体之一，纳米二氧化硅的添加还可以增强包材的形态学与机械性能［36］。纳米包装袋的纵向拉伸强度、直角撕裂强度和断裂标称应变3 个指标均优于普通PE包装袋。另一方面，纳米材料的低渗透性可以调节袋内湿度和气体成分，使氧气和二氧化碳的浓度达到适当比例，既维持了金针菇较低的呼吸强度，又避免了高浓度二氧化碳的伤害，同时也抑制了金针菇的蒸腾和呼吸作用，进而减缓木质化劣变相关的生理生化活动，在贮藏末期较好地保存了营养成分，保持了金针菇良好的质地和对病害病菌的抵抗力，从而达到延缓品质劣变和衰老的作用。

此外，由于防雾剂、分散剂等辅助剂的添加，造成纳米袋在透明度上有所欠缺，可能会影响包装产品的美观度，这个问题在后续的研究中有待进一步改进。另一方面，对于聚合物基纳米复合材料，其材料中添加的活性成分是否会迁移到包装对象中以及因此产生的安全风险，还需要进一步实验研究［37-38］。由于聚合物与纳米粒子间的相互作用，并且纳米粒子添加量很低，食品形态的多样性等因素造成纳米粒子与包装食品接触情况比较复杂，传统的测定评价方法无法客观、准确地反映食品包装中纳米粒子的安全性。综上，如何全面、系统地评价食品包装中纳米粒子的安全性以及活性粒子的迁移状况，是下一步实验研究的重点。

3　结 论

本实验在前期研制的基础上，制备了一种添加纳米银、纳米二氧化钛、纳米凹凸棒土、纳米二氧化硅的复合包装材料，并应用于金针菇贮藏，研究其对金针菇采后品质变化和木质化劣变的影响。实验结果表明，相比于普通聚乙烯包装，纳米包装袋能够较好地保持金针菇的外观和质地，同时抑制苯丙烷类代谢途径关键酶的活性，延缓木质素的积累，从而有利于金针菇在贮藏销售期间保持良好的感官品质和营养价值，延长货架期。纳米保鲜技术在食用菌的贮藏保鲜中具有广泛的应用前景。

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Effect of Nano-Packing on Lignification and Related Enzyme Activities of Flammulina velutipes

FANG Donglu1, CHANG Shijie1, ZHAO Liyan1, AN Xinxin1, HU Qiuhui2, YANG Wenjian2,*
（1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China）

A polyethylene （PE） packing material containing nano-Ag, nano-TiO2, attapulgite and nano-SiO2was prepared and applied in the preservation of Flammulina velutipes and its effects on sensory quality and lignification of F. velutipes were determined during 14-day storage at 4 ℃. The influence of nano-packing material on the lignification of F. velutipes was studied by tracking the changes in texture, weight loss, soluble protein contents, lignin contents, the activities of phenylalnine ammonialyase （PAL）, cinnamyl alcohol dehydrogenase （CAD）, and peroxidase （POD） as well as cell microstructure. The normal PE material was used as control. After 14 days of storage, the maximum shearing force, weight loss, PAL, CAD and POD activities of F. velutipes packed with nano-packing material were 1.191 kg, 0.51%, 20.72 U/mg, 41.23 U/mg, 10.09 U/mg, respectively, which were significantly lower than those of the control （P ＜ 0.05）. On the other hand, the lignin content in nano-packaging samples increased by 4.7% while that in the control increased by 14.2% compared with the initial level. Nano-packing material has the potential to maintain the preservation quality and extend the shelf life of F. velutipes by inhibiting the accumulation of lignin and increasing the related enzyme activities.

Flammulina velutipes； nano-packing； preservation； lignifi cation； shelf-life

10.7506/spkx1002-6630-201620044

TS206.4

A

1002-6630（2016）20-0261-07

方东路, 常诗洁, 赵立艳, 等. 纳米包装材料对金针菇木质化及相关酶活性的影响［J］. 食品科学, 2016, 37（20）： 261-267.

DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620044. http：//www.spkx.net.cn

FANG Donglu, CHANG Shijie, ZHAO Liyan, et al. Effect of nano-packing on lignification and related enzyme activities of Flammulina velutipes［J］. Food Science, 2016, 37（20）： 261-267. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201620044. http：//www.spkx.net.cn

2016-06-20

江苏省自然科学基金项目（BK20141009）；国家自然科学基金青年科学基金项目（31401552）

方东路（1989—），男，博士研究生，研究方向为食用菌贮藏保鲜。E-mail：fangdonglu_@126.com

杨文建（1981—），男，副教授，博士，研究方向为食品加工与贮藏保鲜。E-mail：lingwentt@163.com