四株单菌及其复配后复合菌剂净水效果初步研究

王寅，谢金萍，梁晶晶

（1.山东省计量科学研究院，山东济南250014；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛266061）

四株单菌及其复配后复合菌剂净水效果初步研究

王寅1，谢金萍2，梁晶晶2

（1.山东省计量科学研究院，山东济南250014；2.青岛根源生物技术集团有限公司，山东青岛266061）

本研究对目前水产养殖中常用的枯草（Bacillus subtilis，Bs）、蜡样（Bacillus cereus，Bc）、地衣（Bacillus licheniformis，Bl）三株芽孢杆菌和一株粪链球菌（Fecal streptococcus，Fs）进行净水效果初步比较，主要指降解氨氮、亚硝酸盐能力的比较。将菌粉定量添加到自配的模拟污水培养基中摇床培养，不加菌的模拟污水培养基作为对照。结果表明：枯草芽孢杆菌的降氨氮能力优于其他三种菌，5 d后氨氮去除率100%，蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和粪链球菌也均有一定的降解氨氮能力。降亚硝酸盐效果最好的单菌仍是枯草芽孢杆菌，亚硝酸盐去除率第二天为85.60%，第三天为100%。地衣芽孢杆菌和粪链球菌降亚硝酸盐的能力也很好，在第五天亚硝酸盐浓度基本为0。而蜡样芽孢杆菌降亚硝酸盐的效果不如其他3种菌，五天后降解率仅为61.10%。根据单株菌净水效果的结果，做菌种复配净水试验。共得出七种配方复合菌剂，同样在模拟污水培养基中进行培养。结果得出，配方E为最优配方，第三天氨氮去除率为81.33%，第六天时去除率达到93.58%，第五天时亚硝态氮基本降为0，净水效果突出。

芽孢杆菌；氨氮降解；亚硝酸盐降解；复合菌剂

随着水产养殖规模的不断扩大，集约化养殖程度的不断提高，水产养殖池的富营养化程度越来越高（林斌等，1994）。有机物的大量投放使残饵、鱼虾的排泄物等富营养因子共存于一个水体，加上池塘自净与调节能力的降低，营养水体中化学需氧量（COD）、生物耗氧量（BOD）、氨氮、硝酸盐与亚硝酸盐、硫化物等指标严重超标，池塘水质恶化，鱼虾病害频频发生（单志欣，2000；钟硕良等，1997）。

抗生素在养殖池中的过量或频繁使用不仅会使细菌耐药性增加，破坏和干扰养殖环境的正常生物系统，导致养殖水体中微生物的生态失调，而且会产生二重污染，在生物体内残留，严重影响水产品的品质（Boyd，1999；王雷等，1994）。

如果能有效避免有机物质及其分解产物的过量积累，就能获得良好的水质条件。正是基于这一原理，选育和培养高效安全的微生物菌剂，通过生物直投法净水新技术直接投放到受污染的水体中，就能改善和恢复养殖水体的生态环境，减少鱼虾疾病的发生，达到净水的目的（梁运祥等，2003）。各种芽孢杆菌尤其是枯草芽孢杆菌是微生态制剂的优势菌，能迅速分解水体中的有机物，促进硫化物和亚硝酸盐的氧化，并且具有快速的生长繁殖能力和适应环境的能力。熊伟等（2003）在海南斑节对虾养殖池中使用枯草芽孢杆菌制剂后，养殖池中的有害物质如亚硝酸盐、硫化氢显著减少，COD较对照池大幅度下降。本研究以三种芽孢杆菌和一种粪链球菌的单菌及其复合菌剂对模拟污水中氨氮、亚硝态氮的降解能力进行考察。

1　材料与方法

1.1供试菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、粪链球菌（fecal streptococcus）。

1.2培养基营养琼脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏3 g/L，氯化钠5 g/L，琼脂17 g/L，pH 7.2。121℃高压灭菌30 min。

MRS培养基：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母粉5 g/L，磷酸氢二钾2 g/L，柠檬酸三铵2 g/L，乙酸钠5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐温-80 1 g/L，七水硫酸镁0.58 g/L，四水硫酸锰0.25 g/L，碳酸钙5 g/L，琼脂20 g/L。116℃高压灭菌30 min。

模拟污水培养液Ⅰ：葡萄糖0.5 g/L，磷酸氢二钾0.1 g/L，硫酸镁晶体0.05 g/L，硫酸铵0.04 g/L，亚硝酸钠标准储备液（100 ug/mL）12 mL/L。调pH为7.0，116℃高压灭菌30 min。

模拟污水培养液Ⅱ：葡萄糖0.5 g/L，磷酸氢二钾0.1 g/L，硫酸镁晶体0.05 g/L，硫酸铵0.04 g/L，亚硝酸钠标准储备液（100 ug/mL）10 mL/L。调pH为7.0，116℃高压灭菌30 min。

1.3菌种复配方案将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和粪链球菌4株菌的菌粉先进行菌量计数，再按一定比例复配使总菌量为200亿/g，以滑石粉作载体。不同配方中各种菌的添加比例如表1所示。

表1　不同配方中各种菌的添加量

1.4接种量用涂布法在营养琼脂平板培养基上将枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌的菌粉分别计数，用倾注法以MRS培养基计出粪链球菌菌粉的菌量。根据产品实际使用量设定接种量为107CFU/L。

1.5测定项目及方法氨氮检测方法：奈氏试剂法；亚硝态氮检测方法：分光光度法（GB 7493-87）；氨氮、亚硝态氮标准曲线见图1和图2。

图1　氨氮标准曲线

图2　亚硝态氮标准曲线

1.6试验方案

1.6.1单菌净水方案试验共分五组，枯草芽孢杆菌组（Bs）、蜡样芽孢杆菌组（Bc）、地衣芽孢杆菌组（Bl）、粪链球菌组（Fs）和对照组（D）。每组3个平行，共15个500 mL三角瓶。每个三角瓶内加入150 mL的模拟污水培养液Ⅰ，116℃高压灭菌30 min。再分别称取0.1g菌粉到具玻璃珠的100 mL灭菌水中，放摇床内摇匀。根据实际菌量算出各菌种的添加量，分别加入各试验组，对照组不加菌。最后28℃、180 r/min摇床培养。每天或每两天取样，离心检测。

1.6.2配方净水方案试验分两次进行，每次四个试验组，一个对照组。第一次试验组为方案A、B、C、D，第二次试验组为方案A、E、F、G。每组3个平行，共15个500 mL三角瓶。每个三角瓶内加入150 mL的模拟污水培养液Ⅱ，116℃高压灭菌30 min。再称取0.1 g复合菌剂到具玻璃珠的100 mL灭菌水中，放摇床内摇匀。根据实际菌量算出各配方的添加量，分别加入各试验组。最后28℃、180 r/min摇床培养。每天取样，离心检测。

2　结果及分析

2.1单菌净水结果

2.1.1不同菌株降氨氮效果由图3可见，四株菌对氨氮均有降解作用。1 d时各组氨氮降低均不明显。在第2 d时各试验组均有降低，Bs、Bc、Bl氨氮去除率均在10%以上，而Fs的氨氮去除率很低。第三天时Bs的氨氮去除率最高，达到78.8%，Bc、Bl、Fs的氨氮去除率均在36%左右。第五天时Bs的氨氮去除率达到100%，Fs的氨氮去除率继续升高，为54.28%，而Bc、Bl组的氨氮浓度有所升高。第六天Bs氨氮浓度仍然是0，Fs的氨氮去除率达到73.52%，Bc氨氮浓度基本维持不变，Bl氨氮浓度仍有升高。综合来看，Bs的降氨氮效果最好，第五天就能完全去除。Fs的氨氮降解效果也很明显，只是作用时间比Bs要晚。而Bc和Bl有一定降氨氮能力，但效果不突出。

图3　不同菌株降氨氮效果比较

2.1.2不同菌株降亚硝态氮效果由图4可见，四株菌对亚硝态氮均有降解作用。Bs在第二天时亚硝态氮去除率已达到85.60%，第三天时亚硝态氮浓度几乎为零，去除率高达100%。Bl在前三天时氨氮浓度缓慢降低，在第五天亚硝态氮浓度降为零。Fs在前三天亚硝态氮浓度基本维持不变，在第五天时亚硝态氮浓度降为零。Bc在6 d检测时间内亚硝态氮浓度一直在降，第六天时亚硝态氮去除率达到61.10%。综合来看，四株菌都有降亚硝态氮的功能。Bs降亚硝态氮效率明显要高于其他菌。Bl、Fs的降亚硝态氮效果也很好，第五天时就能完全去除。与其他菌相比，Bc对亚硝态氮起作用的速度慢，且去除率也低。

图4　不同菌株降亚硝态氮效果对比

2.2配方净水效果

2.2.1配方A、B、C、D降氨氮、亚硝态氮效果比较由图5可见，各配方在24 h内氨氮浓度均有升高，对照组也有升高。在48 h以后配方A、B、C、D组均使氨氮浓度持续降低，而对照组仍在升高，3 d后对照组也开始降低。可见，各种配方均有降氨氮能力。其中配方A的降氨氮能力更强，在第五天氨氮去除率达到58.7%。各配方降氨氮能力排序为A＞C＞D＞B。

图5　配方A、B、C、D降氨氮试验结果

由图6可见，各配方对亚硝态氮也均有降解功能。在第五天时所有试验组亚硝态氮基本检测不到。其中A配方在第二天时亚硝态氮去除率为92.4%，第四天去除率为100%。所有配方中A配方的降亚硝态氮能力最强，其他依次为B、D、C。第四天时对照组亚硝态氮浓度不再升高且有所降低可能与染菌有关。

图6　配方A、B、C、D降亚硝态氮试验结果

2.2.2配方A、E、F、G降氨氮、亚硝态氮效果比较由图7可见，配方E、F、G、A都有降氨氮的能力。配方E降氨氮能力最好，第三天氨氮去除率为81.33%，第六天时去除率达到93.58%。其他三个配方效果要略差于E，依次是F、G、A。

图7　配方A、E、F、G降氨氮效果

如图8所示，各配方均有降亚硝态氮的功效，配方G降亚硝态氮速度最快，第三天时亚硝态氮浓度降为0。其他三个配方第五天时亚硝态氮才基本降没。

图8　配方A、E、F、G降亚硝酸盐效果比较

由第一次试验可以得出，A配方的降氨氮、亚硝态氮能力明显优于B、C、D配方。从第二次试验得出E配方去除氨氮和亚硝态氮的能力要优于F配方和A配方。G配方与其他配方比虽然降亚硝态氮能力突出但降氨氮能力较差。综合考虑，E配方为最优配方。

3　讨论与结论

研究表明，具有高效降氮能力的细菌既有自养型细菌硝化细菌、光合细菌等，也有恶臭假单胞菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌等异养型细菌（王瑞君和魏银萍，2005；丁雷和赵德炳，2001）。芽孢杆菌因为具有稳定性好、抗性强、耐高温、耐酸碱、产酶丰富、抑制病原菌繁殖、促进动物营养的消化吸收、分解有机污染物、净化水质等优点而被广泛应用于水产动物养殖中，其中枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是水产养殖中应用较多的菌株，这2种芽孢杆菌被农业部列为安全使用菌株。

目前在水产养殖中应用最广的是复合菌剂。复合菌剂是基于微生态学理论，利用微生物菌群的联合作用，由两种或两种以上有益的且互不拮抗的微生物菌种制备的活菌制剂。水产养殖中被污染水体是一个多重污染、多变的环境，单一的微生物只能解决其中一个或者部分问题，而符合的微生物菌群更加复合天然的微生态系统，较单菌表现出更优的净化和修复效能，如外国开发的EM制剂、CBM制剂、BZT微生物制剂等一些复合菌剂。

本试验对水产养殖中最常见的四株单菌做水质净化效果比较，其中枯草芽孢杆菌降氨氮和亚硝态氮的性能最好。再用四种菌制成不同含量的复合菌剂，对其进行净水效果验证，得出最优的净化水质配方，形成有效产品。

［1］丁雷，赵德炳.光合细菌在水产养殖上的应用研究与进展［J］.水利渔业，2001，21（1）：23～25.

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［6］王瑞君，魏银萍.水质微生态制剂的种类和应用［J］.重庆科技学院报，2005，7（3）：71～74.

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［9］BOYD C E，MAGSSAUT L.Risks associated with the use of chemicals in pond aquaculture［J］.Aqua Engin，1999，20（2）：113～132.

The present study was carried out to investigate the effect of four probiotic strains including Bacillus subtilis，Bacillus cereus，Bacillus licheniformis and Fecal streptococcus on water purification.Different strains and their combinations were cultured in sewage medium as trentment groups，sewage medium with no supplementation served as control. After 24 h，fermentations samples were taken from each group for analysis of degradation of ammonia-nitrogen and nitritenitrogen.Results showed that B.subtilis had greater capacity of ammonia-nitrogen degradation than other three strains，and removal rate reached 100%after 5 days.B.cereus，B.licheniformis，and F.streptococcus also had degradation capacity to a degree.Furthermore，nitrite degradation rate of B.subtilis was higher than other strains，with a rate of 85.60%at day 2，and 100%at day 3.B.licheniformis and F.streptococcus also had great nitrite degradation capacity，and nitrite concentration decreased to 0 at day 5.B.cereus could not degrade nitrite efficiently，with a degradation rate of 61.10%after 5 days. According to each strain’s capacity of water purification，the strains were combined at a certain ratio，and then cultured in sewage medium，the optimal combination was obtained with an ammonia-nitrogen removal rate of 81.33%at day 3，and 93.58%at day 6，nitrite concentratiuon also decreased to 0 at day 5.The results indicated that this combination had an efficient water purification property.

bacillus；ammonia nitrogen degradation；nitrite degradation；compound bacterium agent

S816.7

A

1004-3314（2016）13-0035-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161309