富氢液通过自噬途径下调中波紫外线诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达

张秉新 邢卫斌 付国俊 陈红光

300193天津中医药大学第一附属医院皮肤科（张秉新）；天津市第五中心医院皮肤科（邢卫斌）；河北省沧州市人民医院皮肤科（付国俊）；天津医科大学总医院麻醉科（陈红光）

富氢液通过自噬途径下调中波紫外线诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达

张秉新 邢卫斌 付国俊 陈红光

300193天津中医药大学第一附属医院皮肤科（张秉新）；天津市第五中心医院皮肤科（邢卫斌）；河北省沧州市人民医院皮肤科（付国俊）；天津医科大学总医院麻醉科（陈红光）

目的 探讨氢气是否能通过自噬途径调节中波紫外线（UVB）诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达。方法 将培养的HaCaT细胞分为空白对照组（不做任何处理），氢气组（仅用富氢培养液培养），1、10、50 mJ/cm2UVB 组，1、10、50 mJ/cm2UVB+氢气组，50 mJ/cm2UVB+3甲基腺嘌呤（3MA）组，50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素组，50 mJ/cm2UVB+3MA+氢气组，50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素+氢气组。细胞经过不同处理培养12 h后，噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖，LDH试剂盒检测乳酸脱氢酶（LDH），细胞提取蛋白检测自噬蛋白LC3和Beclin1的表达，上清液用ELISA检测炎症因子肿瘤坏死因子（TNF）α、白细胞介素（IL）-1β、HMGB1和IL-6的水平。结果 与空白对照组相比，UVB诱导的HaCaT细胞LDH释放增多，细胞活力下降，自噬蛋白LC3和Beclin1表达增加，炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6释放增加（均P＜0.05）。与UVB组相比，氢气可减少LDH释放，提高细胞活力，自噬蛋白LC3和Beclin1表达进一步增加，炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（均P＜0.05）。与50 mJ/cm2UVB组相比，50 mJ/cm2UVB+3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达进一步增加（P＜0.05），而50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达减少（P＜0.05）。与50 mJ/cm2UVB+氢气组相比，50 mJ/cm2UVB+氢气+3MA组炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6表达增加（P＜0.05）。结论 UVB照射可以诱发自噬蛋白表达增加；富氢液可以下调UVB诱导的HaCaT细胞炎症因子的表达，而这一过程是通过激活自噬途径实现的。

紫外线；自噬；炎症趋化因子类；氢气；HaCaT细胞

紫外线照射是引起光线性皮肤病的因素之一，其中以中波紫外线（UVB）对角质形成细胞的影响最大，能诱导角质形成细胞分泌多种细胞因子，如，肿瘤坏死因子 α（TNF-α），白细胞介素（IL）-6，IL-8，iNOS等，引起皮炎及免疫反应［1-2］。细胞自噬是真核生物普遍存在的自稳机制，在细胞自我保护和生存等过程中发挥作用［3］。细胞自噬不仅可通过调控炎症反应发挥细胞保护效应［3］，还可调节UVB引起的人成纤维细胞和角质形成细胞的细胞损伤［4-5］。据报道，氢气可以通过抗炎和调节自噬作用发挥对疾病的治疗作用［5-6］。因此，本研究探讨氢气是否可减轻UVB引起的HaCaT细胞释放的炎症因子的表达，这一过程是否通过自噬的调节发挥作用，进而明确氢气治疗疾病的相关机制。

资料与方法

一、资料

人HaCaT细胞来源于美国ATCC细胞库。胎牛血清、胰蛋白酶、EDTA、噻唑蓝（MTT）（美国 Sigma公司），乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所），β肌动蛋白、LC3和Beclin1抗体、山羊抗人辣根过氧化物酶（HPR）标记二抗（美国Abcom 公司），TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6试剂盒（美国RD公司）。紫外线光疗仪为上海希格玛高技术有限公司产品。3甲基腺嘌呤（3MA）购自美国Sigma公司。

二、方法

1.含氢培养液制备：参考文献［7］方法，在0.5mPa压力下加压暴露4 h，使纯氢气溶解于正常含10%FBS的DMEM培养基中并达到饱和水平，4℃贮存。富氢液新鲜制备，利用氢电极（丹麦Unisense公司）室温检测氢浓度为0.6 mmol/L，且饱和浓度至少可存放1周。为了保证稳定的氢气浓度，含氢培养液至少每周配置1次。

2.细胞培养及分组处理：将HaCaT细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基稀释到1×106个/ml，接种于6孔培养板，置于37℃、含体积分数为5%CO2的培养箱中常规培养，将处于对数生长期的细胞用于实验。根据实验设计分组为：①空白对照组，不做任何处理；②氢气组：未经UVB照射的细胞用富氢培养液培养；③1、10、50 mJ/cm2UVB组：分别用1、10、50 mJ/cm2UVB 照射细胞；④1、10、50 mJ/cm2UVB+氢气组：分别用1、10、50 mJ/cm2UVB照射细胞+富氢培养液培养；⑤UVB+3MA组：50 mJ/cm2UVB照射细胞+3MA（自噬抑制剂）；⑥UVB+雷帕霉素组：50 mJ/cm2UVB照射细胞+雷帕霉素（自噬激活剂）；⑦UVB+3MA+氢气组：50 mJ/cm2UVB照射细胞+3MA+富氢培养液培养；⑧UVB+雷帕霉素+氢气组：50 mJ/cm2UVB照射细胞+雷帕霉素+富氢培养液培养。

［8］及预实验结果，3MA和雷帕霉素（浓度分别为1 mmol/L、0.1 μmol/L）在UVB照射前1 h加入培养基。UVB照射前将培养基吸去，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗后，加入薄层PBS，以刚好覆盖细胞为度。根据预实验结果，用1、10、50 mJ/cm2照射剂量分别照射30 s，照射时细胞与光源间的照射距离为15 cm。照射后立即弃去上覆的PBS，加入新鲜培养基继续培养12 h，进行相关检测。

3.LDH检测：各组细胞经过不同处理并培养12h后，根据LDH试剂盒说明检测LDH释放水平。

4.MTT法检测细胞增殖：各组细胞经过不同处理并培养12 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，37℃孵育4 h后弃去上清液，加入200 μl二甲基亚砜（DMSO），室温振荡15 min，用酶标仪（美国Clinibi公司）选择490 nm波长测定每孔细胞的吸光度值（A值），观察HaCaT细胞的细胞活力变化。

5.Western印迹法检测自噬蛋白LC3和Beclin1的表达：按照上述实验细胞培养12 h后，收集细胞，留取蛋白，用蛋白酶抑制剂裂解蛋白，收集后置于-80℃冰箱保存备用。将蛋白进行SDS-PAGE蛋白质电泳1 h，行PVDF膜转移蛋白质1 h，血清封闭2 h，加入一抗β肌动蛋白（稀释度1∶1 000），LC3或Beclin1（稀释度1∶500）4℃过夜，洗膜，加入二抗HRP（稀释度1∶5 000）孵育2 h，然后进行化学发光显像，以目的蛋白条带积分吸光度值与β肌动蛋白条带积分吸光度值的比值反映目的蛋白表达水平。

6.ELISA 检测炎症因子 TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6的水平：细胞按照上述实验培养12 h后，收集标本，离心取上清液，根据炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6检测试剂盒说明书，采用用ELISA 法检测 TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-6的表达水平。

7.统计学处理：用SPSS18.0软件，正态分布的计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、氢气对不同剂量UVB照射HaCaT细胞的LDH和细胞增殖的影响

与空白对照组相比，低剂量UVB对细胞无明显影响（P＞0.05），而 10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB 可明显诱发细胞损伤，LDH增多、细胞活力降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性变化。给予富氢液处理低剂量UVB照射的细胞后，与1 mJ/cm2UVB组相比，LDH和MTT无明显变化（P＞0.05）；给予富氢液处理10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB照射的细胞后，与同剂量UVB组相比，细胞LDH释放减少，细胞活力增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 氢气对不同剂量UVB照射的HaCaT细胞LDH和细胞增殖的影响（±s）

表1 氢气对不同剂量UVB照射的HaCaT细胞LDH和细胞增殖的影响（±s）

注：n=6。a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与 10 mJ/cm2UVB 组比较，P＜0.05；c：与50 mJ/cm2UVB组比较，P＜0.05

组别 乳酸脱氢酶（%） 噻唑蓝（A值）空白对照组 100±0 1.823±0.073氢气 98.2±6.1 1.812±0.148 1 mJ/cm2UVB 112.6±11.3 1.721±0.127 10 mJ/cm2UVB 148.5±13.6a 0.984±0.091a 50 mJ/cm2UVB 199.9±16.5a 0.826±0.082a 1 mJ/cm2UVB+氢气 104.4±10.8 1.791±0.131 10 mJ/cm2UVB+氢气 122.2±13.8b 1.327±0.107b 50 mJ/cm2UVB+氢气 164.6±14.3c 1.118±0.087c F值 75.11 114.8 P值＜0.01＜0.01

二、氢气对不同剂量UVB照射HaCaT细胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影响

与空白对照组相比，1 mJ/cm2UVB虽可引起HaCaT细胞自噬蛋白LC3和Beclin1轻微升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），而10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB可明显诱发自噬蛋白LC3和Beclin1表达呈剂量依赖性增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。给予富氢液处理并经不同剂量UVB照射后，与相同剂量UVB组相比，1 mJ/cm2组两蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），10 mJ/cm2和50 mJ/cm2UVB 组自噬蛋白LC3和Beclin1表达进一步增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2，图 1。

表2 氢气对不同剂量UVB照射HaCaT细胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影响（±s）

表2 氢气对不同剂量UVB照射HaCaT细胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的影响（±s）

注：n=6。a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与 10 MJ/CM2UVB组比较，P＜0.05；c：与50 mJ/cm2UVB组比较，P＜0.05

组别 LC3 Beclin1空白对照组 0.112±0.011 0.109±0.013氢气 0.123±0.013 0.113±0.011 1 mJ/cm2UVB 0.236±0.034 0.175±0.015 10 mJ/cm2UVB 0.421±0.061a 0.252±0.026a 50 mJ/cm2UVB 0.447±0.073a 0.336±0.031a 1 mJ/cm2UVB+氢气 0.316±0.032 0.172±0.016 10 mJ/cm2UVB+氢气 0.686±0.067b 0.361±0.032b 50 mJ/cm2UVB+氢气 0.702±0.094c 0.419±0.040c F值 121.0 178.3 P值＜0.01＜0.01

图1 Western印迹法检测氢气对不同剂量UVB照射HaCaT细胞的自噬蛋白LC3和Beclin1的表达 与空白对照组相比，10、50 mJ/cm2UVB可明显诱发自噬蛋白LC3和Beclin1表达呈剂量依赖性增加。给予富氢液处理并经不同剂量UVB照射后，与相同剂量UVB组相比，自噬蛋白LC3和Beclin1表达进一步增加。1：空白对照组；2：空白对照组 + 氢气；3：UVB1；4：UVB2；5：UVB3；6：UVB1+氢气；7：UVB2+氢气；8：UVB3+氢气

三、富氢液通过自噬途径对UVB照射的HaCaT细胞炎症因子的影响

与空白对照组相比，50 mJ/cm2UVB组细胞炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和HMGB1 释放明显增加，差异有统计学意义（均P＜0.05）。与50 mJ/cm2UVB组相比，50 mJ/cm2UVB+氢气组炎症因子显著降低，50 mJ/cm2UVB+3MA组各炎症因子显著增加，而50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素组则反之，差异有统计学意义（均P＜0.05）。与50 mJ/cm2UVB+氢气组相比，50 mJ/cm2UVB+氢气+3MA组炎症因子增加，差异有统计学意义（均P＜0.05），说明3MA翻转了富氢液对UVB照射细胞的炎症因子过量释放的抑制作用。此外，与50 mJ/cm2UVB+氢气组相比，50 mJ/cm2UVB+氢气+雷帕霉素组炎症因子降低。见表3。

表3 氢气对UVB照射HaCaT细胞的炎症因子的表达变化（±s）

表3 氢气对UVB照射HaCaT细胞的炎症因子的表达变化（±s）

注：n=6。a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与 50 mJ/cm2UVB 组比较，P＜0.05；c：与 50 mJ/cm2UVB+ 氢气组比较，P＜0.05

组别 TNF-α（ng/L） IL-1β（ng/L） IL-6（ng/L） HMGB1（μg/L）空白对照组 143.6±15.7 87.6±12.7 57.6±6.3 2.1±0.3 50 mJ/cm2UVB 985.4±89.3a 748.4±88.2a 461.4±53.5a 24.6±2.4a 50 mJ/cm2UVB+3MA 1344.4±121.7b 937.5±101.6b 537.7±49.9b 33.5±2.9b 50 mJ/cm2UVB+雷帕霉素 682.1±57.8b 471.9±37.6b 248.5±31.1b 15.6±2.1b 50 mJ/cm2UVB+氢气 593.7±49.1b 411.8±39.9b 262.4±33.2b 13.8±2.0b 50 mJ/cm2UVB+氢气+3MA 1011.1±111.7c 785.0±89.9c 488.9±51.8c 26.3±2.5c 50 mJ/cm2UVB+氢气+雷帕霉素 435.3±41.5 348.9±33.1 222.4±25.3 11.8±1.4 F值 209.1 160.5 157.9 201.6 P值＜0.01＜0.01＜0.01＜0.01

讨 论

造成皮肤光损伤的紫外线主要为UVB，由角质形成细胞所组成的表皮层是UVB损伤的靶组织，且UVB照射可导致皮肤角质形成细胞的增殖能力下降［7，9］。本实验通过给予不同剂量的UVB照射HaCaT细胞后，出现细胞损伤，LDH释放增加，细胞活力降低，且随着照射剂量的增加，细胞损伤和细胞活力下降增加。紫外线还可通过炎症损伤调控皮肤的形态和功能，可诱发细胞核和线粒体DNA损伤，并产生的大量细胞因子，如IL-1、IL-6等，从而引起细胞的损伤与修复功能异常，诱发皮肤红斑、老化、光敏性疾病、异常的DNA合成、DNA损伤、免疫抑制等［10］。本实验结果显示，UVB照射可通过增加炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的过量释放引起HaCaT细胞的炎症反应。

自噬是清除损伤蛋白和细胞器的有效形式［11］。研究表明，细胞可通过激活自噬来抵抗炎症［12］。LC3参与自噬体的形成，它的多少与自噬小泡数量成正比，所以LC3的表达可以反应自噬的活性［13］。Beclin1是参与自噬调控的重要基因，通过与ClassIII/PI3K形成复合物参与自噬体的形成［14］。本研究中，对HaCaT细胞系进行不同剂量UVB照射，结果显示，UVB照射HaCaT细胞可诱发自噬蛋白LC3和Beclin1的表达，且呈剂量依赖性增加。在进一步应用自噬诱导剂雷帕霉素和抑制剂3MA的实验中发现，自噬的诱发可以减少UVB导致的HaCaT细胞炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1的过量释放，而自噬的抑制则进一步增加UVB照射的HaCaT 细 胞 炎 症 因 子 TNF-α、IL-1β、IL-6 和HMGB1的释放水平，提示通过自噬途径可调节UVB照射的HaCaT细胞炎症因子的释放。

近年来研究发现，氢气通过抗炎等作用发挥对疾病的治疗作用。氢气及富氢液通过抗炎反应、抗氧化和抗凋亡等作用，可减轻小鼠变应性皮炎炎症因子 TNF-α、IL-6、IL-17 和INF-γ 的释放［7］等。本研究中，氢气可以降低UVB照射的HaCaT细胞炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和HMGB1 的释放。此外，氢气还可以增加UVB照射的HaCaT细胞自噬蛋白LC3和Beclin1的表达。本文结果显示，通过给予UVB照射的HaCaT细胞雷帕霉素和富氢液处理，细胞炎症因子的释放减少，而给予UVB照射的细胞3MA和富氢液处理，细胞的炎症因子仍旧增加，表明3MA逆转了富氢液对UVB照射HaCaT细胞的抑制炎症因子释放的作用。氢气可能通过激活自噬，使UVB照射的细胞经过自噬途径裂解，裂解后细胞内容物释放并为新细胞的合成提供原料，而UVB导致的炎症因子释放也将随着细胞的裂解而减少或终止。可见氢气通过自噬蛋白的表达来反映自噬的激活，为细胞或组织正常生长提供重要的保障。

参考文献

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Hydrogen-rich liquid down-regulates the expressions of inflammatory factors by ultraviolet B-induced human HaCaT keratinocytes through the autophagy pathway

Zhang Bingxin,Xing Weibin,Fu Guojun,Chen Hongguang
Department of Dermatology,First Teaching Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China（Zhang BX）;Department of Dermatology,Tianjin Fifth Centre Hospital,Tianjin 300450,China（Xing WB）;Department of Dermatology,Cangzhou People′s Hospital,Cangzhou 061000,Hebei,China（Fu GJ）;Department of Anesthesiology,Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China（Chen HG）

ObjectiveTo investigate whether hydrogen can regulate the expressions of inflammatory factors by ultraviolet B （UVB）-induced human HaCaT keratinocytes through the autophagy pathway.MethodsCultured HaCaT keratinocytes were divided into several groups：blank control group receiving no treatment,hydrogen group cultured in hydrogen-rich medium,three UVB groups irradiated with UVB at 1,10,50 mJ/cm2respectively,three UVB+hydrogen groups irradiated with UVB at 1,10,50 mJ/cm2respectively followed by culture in hydrogen-rich medium,UVB+3MA group pretreated with the autophagy inhibitor 3MA for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2,UVB+rapamycin group pretreated with the autophagy activator rapamycin for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2,UVB+3MA+hydrogen group pretreated with 3MA for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2and culture in hydrogen-rich medium,UVB+rapamycin+hydrogen group pretreated with rapamycin for 1 hour followed by UVB radiation at 50 mJ/cm2and culture in hydrogen-rich medium.After additional culture with or without hydrogen for 12 hours,methyl thiazolyl tetrazolium （MTT）assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,Western-blot analysis to measure the expressions of autophagy-associated protein 1 light chain 3（LC3）and Beclin1,and enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）to measure the supernatant levels of inflammatory factors including tumor necrosis factor （TNF）-α,interleukin（IL）-1β,IL-6 and high mobility group protein B1 （HMGB1）,and a test kit was used to determine the level of lactate dehydrogenase（LDH）.ResultsCompared with the blank control group,the 10-and 50-mJ/cm2UVB groups showed significantly increased release of LDH,expressions of LC3 and Beclin1 and supernatant levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1,but decreased cellular proliferative activity（allP＜0.05）.Hydrogen significantly attenuated the release of LDH,down-regulated the supernatant levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1,but up-regulated cellular proliferative activity as well as LC3 and Beclin1 expressions in the 10-and 50-mJ/cm2UVB+hydrogen groups compared with the 10-and 50-mJ/cm2UVB groups respectively （allP＜0.05）.In addition,the levels of TNF-α,IL-1β,IL-6 and HMGB1 were significantly higher in the 50-mJ/cm2UVB+3MA group than in the 50-mJ/cm2UVB group,and higher in the 50-mJ/cm2UVB+3MA+hydrogen group than in the 50-mJ/cm2UVB+hydrogen group,but lower in the 50-mJ/cm2UVB+rapamycin groupthaninthe50-mJ/cm2UVBgroup（allP＜0.05）.ConclusionUVBradiationcanincreasetheexpressionsofautophagyassociated proteins,and hydrogen-rich medium can down-regulate the expressions of inflammatory factors by UVB-induced HaCaT cells through the autophagy pathway.

Ultraviolet rays;Autophagy;Chemokines;Hydrogen;HaCaT cells

Xing Weibin,Email：xingweibin111@163.com

2015-04-20）

（本文编辑：吴晓初）

邢卫斌，Email：xingweibin111@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2016.02.010

国家自然科学基金（81101409、81471842）

Fund program:National Natural Science Foundation of China（81101409,81471842）