表没食子儿茶素没食子酸酯抑制白细胞介素17诱导的角质形成细胞增殖和凋亡

付丹丹 胡华 孙敏 李敏 田中伟

453100 河南卫辉，新乡医学院第一附属医院皮肤性病科

表没食子儿茶素没食子酸酯抑制白细胞介素17诱导的角质形成细胞增殖和凋亡

付丹丹 胡华 孙敏 李敏 田中伟

453100 河南卫辉，新乡医学院第一附属医院皮肤性病科

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对白细胞介素17（IL⁃17）诱导的角质形成细胞损伤的保护作用及其机制。方法实验分空白对照组、IL⁃17组、IL⁃17+EGCG组、IL⁃17+SP600125组和IL⁃17+EGCG+茴香霉素组。CCK⁃8试剂盒检测细胞增殖；流式细胞仪检测细胞凋亡；ELISA试剂盒检测IL⁃6、IL⁃23和IL⁃8的表达；Western印迹检测JNK和P⁃JNK的表达。结果IL⁃17促进HaCaT细胞增殖，且增殖率与IL⁃17浓度有关，90 μg/L IL⁃17组的细胞增殖率最高（P＜ 0.05）。60 μmol/L EGCG显著抑制90 μg/L IL⁃17诱导的细胞增殖（P＜ 0.05），促进细胞凋亡（P＜ 0.05），降低IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8的表达（P＜ 0.05）。与IL⁃17组相比，IL⁃17+EGCG组、IL⁃17+SP600125组的P⁃JNK表达显著下调（P＜ 0.05），细胞增殖率降低（P＜ 0.05），IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8的表达减少（P＜0.05）；与IL⁃17+EGCG组相比，IL⁃17+EGCG+茴香霉素组的P⁃JNK表达显著上调（P＜ 0.05），细胞增殖率和IL⁃6、IL⁃23、IL⁃8的表达均明显上升（P＜ 0.05）。结论EGCG对IL⁃17诱导的HaCaT细胞增殖凋亡、炎症反应等损伤具有保护作用，其保护作用可能与抑制JNK信号通路有关。

角蛋白细胞；儿茶素；白细胞介素17；细胞增殖；细胞凋亡；表没食子儿茶素没食子酸酯

角质形成细胞（KC）具有广泛的生物学特性，是参与炎症反应和皮肤免疫的重要细胞［1⁃2］。白细胞介素17（IL⁃17）是Th17细胞分泌的特征性细胞因子，能够促使角质形成细胞表达多种生物活性成分，并参与皮炎的病理过程。HaCaT细胞具有和正常角质形成细胞相似的生物学特征，可作为体外研究药物及皮肤病的良好模型［3］。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）具有抗氧化、抗炎和抗癌等作用［4］。本研究以IL⁃17诱导的HaCaT细胞为对象，探讨EGCG对角质形成细胞损伤的保护作用及其机制。

材料和方法

一、材料

IL⁃17（美国Peprotech公司）。EGCG（纯度 ≥98%）、JNK抑制剂、Annexin V⁃FITC试剂盒（江苏凯基生物公司），JNK激活剂茴香霉素（美国Santa Cruz公司）。DMEM培养液、胎牛血清（FBS）及1%青链霉素（美国Gibco Invitrogen公司），CCK⁃8试剂盒（日本同仁化学研究所）；IL⁃6、IL⁃23、IL⁃8 ELISA试剂盒（武汉博士德公司），HaCaT细胞（美国ATCC细胞库）。

二、方法

1.HaCaT细胞培养：HaCaT细胞用含10%FBS、1%青霉素、1%链霉素的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2的培养箱中，2～3 d更换1次培养基，当细胞80%融合时进行传代。选择对数生长期HaCaT细胞进行后续实验。

2.细胞分组：不同浓度IL⁃17诱导细胞分组：分别用50、70、90 μg/L的IL⁃17诱导HaCaT细胞，同时设置空白对照组。不同浓度EGCG处理细胞分组：分别用20、40、60 μmol/L的EGCG和90 μg/L IL⁃17共同诱导HaCaT细胞，同时设置空白对照组和90 μg/L IL⁃17单独诱导的IL⁃17组。JNK激活剂茴香霉素和抑制剂SP600125处理细胞分组：空白对照组、IL⁃17组、IL⁃17+EGCG组、IL⁃17+SP600125组、IL⁃17+EGCG+茴香霉素组。

3.CCK⁃8检测：CCK⁃8试剂盒检测12、24、36和48 h时各组细胞增殖水平。每种处理设置4个复孔，每孔加入10 μl CCK⁃8试剂，在37 ℃避光孵育2 h。用酶标仪测定450 nm吸光度A值。

4.流式细胞仪检测：按照不同浓度EGCG诱导细胞组分别进行处理，0.25%胰酶（不含EDTA）消化细胞，PBS洗涤，离心，加入100 μl缓冲液重悬细胞。然后加入5 μl Annexin V⁃FITC 以及5 μl PI于室温避光孵育15 min。随后加入400 μl缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

5.ELISA检测：将细胞进行处理，根据ELISA试剂盒说明书检测IL⁃6、IL⁃23和IL⁃8的表达水平。将稀释的样品加样并盖上封板膜，37℃反应60min。随后洗板5次，加入显色液AB，37℃下显色10 min后加入终止液。在10min之内用酶标仪测定490nm处吸光度A值。

6.Western印迹检测蛋白表达：按照JNK激活剂和抑制剂处理细胞分组分别进行处理，用RIPA细胞蛋白裂解液提取细胞总蛋白。随后进行SDS⁃PAGE凝胶电泳，用半干转方法转至PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭1 h，漂洗3次。分别加入JNK、P⁃JNK和GAPDH一抗（1∶1 000），4℃孵育过夜，漂洗3次。再加入PVDF膜转入二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，漂洗4次。经Odyssey红外激光成像系统扫描，目的蛋白与内参GAPDH灰度值的比值反映蛋白的表达水平。

7.统计学分析：实验重复3次。用GraphPad Prism 5.0软件进行统计学处理，计量资料采用±s表示，实验数据用单因素方差分析进行统计学分析，组间两两比较采用Tukey检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.IL⁃17促进HaCaT细胞的增殖：如图1所示，IL⁃17浓度越高、处理时间越长，细胞增殖率越高。90 μg/L IL⁃17处理48 h后，细胞增殖率提高64.8%。说明IL⁃17可以促进HaCaT细胞的增殖，并且与IL⁃17浓度、处理时间呈正相关。因此，采用90 μg/L IL⁃17诱导HaCaT细胞。

图1 不同浓度白细胞介素（IL）17作用不同时间对HaCaT细胞增殖的影响 a：与空白对照组比较，P＜0.05

2.EGCG抑制IL⁃17诱导HaCaT细胞的增殖：如图2所示，EGCG抑制IL⁃17诱导的HaCaT细胞增殖，并且与EGCG浓度、处理时间呈正相关。EGCG浓度越高、处理时间越长，细胞生长抑制率越高。

3.EGCG促进IL⁃17诱导HaCaT细胞的凋亡：如图3所示，IL⁃17处理使HaCaT细胞的凋亡率显著下降，与空白对照组（17.53%）相比，凋亡率下调至1.32%。与IL⁃17组相比，EGCG组的细胞凋亡率显著增加。20 μmol/L EGCG组、40 μmol/L EGCG组和60 μmol/L EGCG组的凋亡率分别为8.6%、13.3%和15.6%。

4.EGCG抑制IL⁃17诱导HaCaT细胞的炎症因子产生：如图4所示，与空白对照组相比，IL⁃17组的IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8的表达显著上调（P＜ 0.001）。与IL⁃17组相比，EGCG 组的IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8的表达显著下调（P＜0.05），而EGCG浓度越高，炎症因子的表达水平越低。

图2 不同浓度表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）作用不同时间对白细胞介素（IL）17诱导HaCaT细胞增殖的影响 a：与白细胞介素17组比较，P＜0.05

图3 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对白细胞介素17（IL⁃17）诱导HaCaT细胞凋亡的影响

图4 表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对白细胞介素17（IL⁃17）诱导HaCaT细胞炎症因子的影响 a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与IL⁃17组比较，P＜0.05

图5 60 μmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）对白细胞介素17（IL⁃17）诱导HaCaT细胞的JNK信号通路的影响 a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与 IL⁃17组比较，P＜0.05；c：与IL⁃17+EGCG组比较，P＜0.05。1：空白对照组；2：IL⁃17组；3：IL⁃17+EGCG组；4：IL⁃17+SP600125组；5：IL⁃17+EGCG+茴香霉素组 5A：Western印迹检测p⁃JNK和JNK的蛋白表达水平；5B：5A的统计柱状图

5.EGCG抑制IL⁃17诱导HaCaT细胞的JNK信号通路激活：如图5所示，空白对照组、IL⁃17组、IL⁃17+60 μmol/L EGCG组、IL⁃17+SP600125组和IL⁃17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素组间的JNK表达水平差异无统计学意义（图5A）。与空白对照组相比，IL⁃17组P⁃JNK表达水平显著上调（P＜0.001）；与IL⁃17组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG组和IL⁃17+SP600125组P⁃JNK表达水平下调（P＜0.05）；与 IL⁃17+60 μmol/L EGCG 组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素组P⁃JNK表达水平显著上调（P＜0.05）。

6.JNK信号通路抑制介导60 μmol/L EGCG的抗细胞增殖、抗炎作用：如图6所示，与空白对照组相比，IL⁃17组的细胞增殖显著增加（P＜0.05）。与IL⁃17组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG组和IL⁃17+SP600125组的细胞增殖下降（P＜0.05）。与IL⁃17+60 μmol/L EGCG组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG+茴香霉素组的细胞增殖率上升（P＜0.05）。与空白对照组相比，IL⁃17组的IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8表达上调（P＜ 0.05）。与IL⁃17组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG组和IL⁃17+SP600125组的IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8表达下调（P＜ 0.05）。与IL⁃17+60 μmol/L EGCG组相比，IL⁃17+60 μmol/L EGCG+ 茴香霉素组的IL⁃6、IL⁃23和 IL⁃8表达显著上调（P＜ 0.05）。见表1。

图6 JNK信号通路的抑制介导60 μmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的抗细胞增殖作用 a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与IL⁃17组比较，P＜0.05；c：与IL⁃17+EGCG组比较，P＜0.05

表1 JNK信号通路的抑制介导60 μmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

表1 JNK信号通路的抑制介导60 μmol/L表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）的抗炎作用（±s，ng/L）

注：n=3。a：与空白对照组比较，P＜0.05；b：与IL⁃17组比较，P＜0.05；c：与IL⁃17+EGCG组比较，P＜0.05。Ani：茴香霉素

组别空白对照组IL⁃17组IL⁃17+EGCG组IL⁃17+SP600125组IL⁃17+EGCG+Ani组IL⁃6 101.34±18.35 582.25±35.56a 173.27±25.34b 124.46±27.23b 550.24±50.34c IL⁃23 103.45±15.35 452.31±34.56a 188.11±26.34b 147.67±23.23b 390.43±33.21c IL⁃8 1 029.14±90.35 3 657.36±210.56a 1 518.17±162.21b 1 345.83±133.23b 3 125.52±156.56c

讨 论

CCK-8试剂盒和流式细胞仪常用于检测细胞的增殖和凋亡水平。本研究通过ELISA试剂盒检测炎症因子水平、Western印迹检测蛋白水平等方法，探讨了EGCG对HaCaT细胞损伤的作用。研究发现，IL⁃17可能参与了银屑病等免疫性皮肤疾病的发病过程［5］。绿茶多酚对皮肤有保护作用，可以调节炎症反应、细胞异常增殖等生物过程［6］。

本研究发现，IL⁃17浓度越高，HaCaT细胞的增殖率越高，增殖率与IL⁃17的处理时间呈正比，证明IL⁃17可以诱导角质形成细胞异常增殖，这一结果与Jia等［7］的结果一致。已有研究证明，EGCG可以抑制前列腺癌细胞DU145［8］、正常人角质形成细胞［9］的过度增殖。本研究发现，EGCG可以抑制IL⁃17诱导HaCaT的增殖，EGCG浓度越高、处理时间越长，细胞生长抑制率越高。进一步研究发现，EGCG对IL⁃17诱导的HaCaT凋亡降低有抑制作用。另外，研究证明，在IL⁃17的作用下，角质形成细胞可能产生一些炎症细胞因子，这些炎症因子相互作用可能会诱发和加重银屑病［10］。本研究结果显示，IL⁃17诱导HaCaT细胞产生炎症因子，IL⁃6、IL⁃23和IL⁃8的表达显著上调，而EGCG能够显著抑制IL⁃6、IL⁃23和IL⁃8的上调。以上结果提示，EGCG可能在IL⁃17诱导的角质形成细胞损伤中有保护作用。

有研究报道，EGCG可以调控不同种类细胞的MAPK信号通路［11］。本实验表明，EGCG可以抑制IL⁃17诱导HaCaT细胞的JNK信号通路的激活。我们用JNK的抑制剂处理IL⁃17诱导的细胞，发现EGCG和JNK抑制剂有相似的作用，抑制IL⁃17诱导HaCaT细胞的炎症因子IL⁃6、IL⁃23和IL⁃8的表达，抑制细胞增殖，说明EGCG可能是通过抑制JNK信号通路发挥保护作用。为进一步确定EGCG对JNK信号通路的抑制作用，我们进行JNK激活剂茴香霉素处理，发现EGCG的保护作用消失，炎症因子IL⁃6、IL⁃23、IL⁃8的表达和HaCaT细胞的增殖速率与IL⁃17+EGCG组相比显著提高，说明EGCG能够通过抑制JNK信号通路来抑制炎症因子的产生，降低细胞增殖。

综上所述，IL⁃17会引起HaCaT细胞的异常增殖、炎症反应，并激活JNK通路；而EGCG可以通过抑制JNK信号通路减少炎症因子的产生，降低HaCaT细胞的增殖，表明EGCG可通过抑制JNK信号通路保护IL⁃17诱导的角质形成细胞损伤。

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Epigallocatechin gallate inhibits the proliferation and apoptosis of keratinocytes induced by interleukin⁃17

Fu Dandan,Hu Hua,Sun Min,Li Min,Tian Zhongwei
Department of Dermatology and Venereology,The First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University,Weihui 453100,Henan,China

ObjectiveTo evaluate the protective effect of epigallocatechin gallate（EGCG）against interleukin（IL）⁃17⁃induced injury to keratinocytes,and to explore its mechanism.MethodsSome cultured HaCaT cells were divided into 3 groups to be treated with IL ⁃17 alone at concentrations of 50,70,90 μg/L,respectively,with those receiving no treatment as the blank control group.Some HaCaT cells were divided into 5 groups:IL⁃17 group treated with 90 μg/L IL⁃17 alone,IL⁃17+EGCG group treated with 90 μg/L IL⁃17 and 60 μmol/L EGCG,IL⁃17+SP600125 group treated with 90 μg/L IL⁃17 and SP600125（a JAK signaling pathway inhibitor）,IL⁃17+EGCG+anisomycin group treated with 90 μg/L IL⁃17,60 μmol/L EGCG and anisomycin（a Janus kinase signaling pathway activator）,and blank control group receiving no treatment.After different durations of treatment,CCK⁃8 assay was performed to evaluate cellular proliferative activity,flow cytometry to detect cell apoptosis,enzyme⁃linked immunosorbent assay（ELISA）to measure expression levels of IL⁃6,IL⁃23 and IL⁃8,and Western⁃blot analysis to determine protein expressions of c⁃Jun N⁃terminal kinase（JNK）and phosphorylated JNK（P⁃JNK）.ResultsIL⁃17 promoted cellular proliferation of HaCaT cells,and the proliferation rate,which was correlated with the concentration of IL⁃17,reached the maximum in the 90⁃μg/L IL⁃17 group（P＜ 0.05）.EGCG at 60 μmol/L significantly inhibited cellular proliferation of,promoted apoptosis in,and reduced IL⁃6,IL⁃23 and IL⁃8 expressions in,HaCaT cells induced by 90 μg/L IL⁃17（allP＜0.05）.Compared with the IL⁃17 group,the IL⁃17+EGCG group and IL⁃17+SP600125 group both showed significantly decreased P⁃JNK expression,cell proliferation rate and IL⁃6,IL⁃23 and IL⁃8 expression levels（allP＜ 0.05）.However,compared with the IL⁃17+EGCG group,the IL⁃17+EGCG+anisomycin group showed significantly increased protein expression of P⁃JNK,cell proliferation rate and IL⁃6,IL⁃23 and IL⁃8 expression levels（allP＜ 0.05）.ConclusionEGCG protected against IL⁃17⁃induced injury to HaCaT cells,such as abnormal cell proliferation,apoptosis and inflammatory response,likely by inhibiting the JNK signaling pathway.

Keratinocytes;Catechin;Interleukin⁃17;Cell proliferation;Apoptosis;Epigallo⁃catechin gallate

Tian Zhongwei,Email:zhonwt@163.com

2015⁃11⁃25）

（本文编辑：吴晓初）

田中伟，Email：zhonwt@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.09.007

河南省教育厅科学技术研究重点项目（13A320852）；河南省中青年卫生科技创新人才工程（201004159）；河南省医学科技攻关计划项目（201502016）；新乡市科技发展计划项目（15SF26）

Fund programs:Key Program for Science and Technology of Henan Educational Committee（13A320852）;Henan Health Science and Technology Innovation Youth Talent Project（201004159）;Medical Science and Technology Foundation of Henan Province（201502016）;Science and Technology Development Program of Xinxiang City（15SF26）