CREB丝氨酸129位点磷酸化提高miR-132的水平

王翔，胡家劭

（江汉大学医学院，湖北武汉430056）

CREB丝氨酸129位点磷酸化提高miR-132的水平

王翔，胡家劭

（江汉大学医学院，湖北武汉430056）

目的通过磷酸化的环磷酸腺苷效应元件结合蛋白（CREB）的激活，使表达记忆的相关蛋白获得长时记忆，探讨CREB丝氨酸（Ser）129位点的磷酸化对微小RNA-132（miR-132）的影响。方法采用长时程增强作用（LTP）电刺激，尾静脉注射方法给予糖原合成酶激酶3β抑制剂SB216763，应用蛋白质印迹法检测大鼠脑内海马区CREB的磷酸化水平，逆转录-聚合酶链反应检测miR-132的表达情况。结果高频刺激CA3-CA1神经环路可成功诱导LTP，使大鼠海马的CREB Ser129位点的磷酸化水平和miR-132的表达明显升高；SB216763可抑制糖原合成酶激酶3β的活性，从而抑制CREB Ser129的磷酸化，使LTP的斜率增幅明显降低，CREB Ser129的磷酸化水平及miR-132的表达明显降低。结论

CREB Ser129位点的磷酸化通过调节miR-132的表达促进LTP形成，LTP形成过程中CREB Ser129位点的磷酸化可调节miR-132的表达，从而影响长期记忆形成。

cAMP反应元件结合蛋白质；微RNAs；蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶；磷酸转移酶类；糖原合成酶激酶3；长时程增强；电位测定法；记忆

学习记忆的机制研究一直是热点问题，环磷酸腺苷效应元件结合蛋白（cAMP-response element binding protein，CREB）是一种选择性结合CREs的核蛋白。CREB的磷酸化位点包括丝氨酸（Ser）133位点和Ser129位点，一般认为，通过蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）使Ser133位点磷酸化后可使CREB的磷酸化活性增强［1］，而通过糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）使Ser129位点磷酸化则可使CREB活性下降［2］。经PKA磷酸化后，CREB的转录活性可增加10～20倍，CREB的激活可导致记忆相关蛋白表达增加，产生长期记忆［3］。

微小RNA是内源性的非编码RNA，主要作用于转录后的mRNA，抑制蛋白质合成。微小RNA-132（microRNA-132，miR-132）能够通过促进突触后α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（α-amino-3-hydroxy-5-methl-4-isoxazole-propionic acid，AMPA）受体的合成，调节学习记忆［4］。近年来已有文献报道，CREB Ser133位点的磷酸化可以调节miR-132的水平［5-6］，但是有关CREB Ser129位点的磷酸化对miR-132的影响研究尚鲜见相关报道。本研究拟通过长时程增强作用（long-term potentiation，LTP）造模，大鼠尾静脉注射GSK-3β抑制剂，探讨CREB Ser129位点的磷酸化能否调节miR-132的表达，从而分析其对学习记忆的影响。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组20只雄性SD大鼠购于华中科技大学同济医学院动物实验中心，周龄（7.0±1.0）周，体质量（250.0±20.0）g。所有实验动物饲养于有良好光线和充足饮用水及食物的25℃房间，均按照神经科学研究动物使用规定进行动物实验。将20只大鼠分为对照组（Con组）和实验组（LTP组），每组10只。

1.1.2仪器与试剂CREB及其phosphoS129（武汉艾美捷科技有限公司，批号：ab32515、ab47373），TRIZOL（美国英杰生命技术有限公司，批号：15596-026），TAKARA逆转录试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司，批号：D6110A］，引物（美国英杰生命技术有限公司），TAKARA聚合酶链反应（PCR）试剂盒［宝生物工程（大连）有限公司，批号：DRR096A］，GSK-3β抑制剂SB216763（上海拓旸生物科技有限公司，批号：L001075）。

1.2方法

1.2.1电刺激方法Con组大鼠给予脑内海马区一般性刺激；LTP组大鼠给予高频刺激（high frequency stimulates，HFS），具体方法如下：大鼠腹腔给予乌拉坦（氨基甲酸乙酯，6 mL/kg）麻醉，采用电刺激方法激活CA3～CA1环路，根据所查文献确定并记录CA3～CA1通路的LTP情况。通过大鼠脑立体定位图谱确定其脑内海马区CA3坐标（前囟后3.5 mm，旁开4.0 mm，深3.8 mm）和CA1坐标（前囟后4.1 mm，旁开2.4 mm，深2.8 mm）。将记录电极放在CA1区，刺激电极放在CA3区，记录到稳定的波形后，以5～30 mV给予不同大小的刺激幅度，诱导出最大兴奋性突触后电位，选择最大值的30%作为基础刺激强度。在静息状态下给予60次刺激，每次间隔30s；然后给予10次强直刺激，每次刺激50次，间隔2 s；再以静息状态下的刺激强度刺激，每次间隔30 s，240次，记录2 h。根据所得波形，按照该模式统计LTP的增幅和斜率变化，比较静息状态和强直刺激后比值评估LTP强度。

1.2.2miR-132检测

1.2.2.1总RNA提取取两组大鼠海马组织，用液氮冷冻再研磨至细粉或用匀浆器匀浆，最后加入1mLTrizol，反复震荡5 min；室温下静置10 min。每毫升Trizol中加入氯仿200 μL，盖上盖子，剧烈震荡约1 min；室温静置2～5 min，然后10 000 r/min冷冻离心1 min，最上层即为含有RNA的样品，通过电泳检测RNA质量。

1.2.2.2RNA逆转录采用TAKARA逆转录试剂盒，取1 μg总RNA，按照试剂盒相应步骤及试剂，37℃、15min，85℃、5 s，最后室温冷却检测RNA浓度，-20℃保存。1.2.2.3miR-132检测使用TAKARA PCR试剂盒检测miR-132水平，每个样品设置3个重复。引物：正义引物为5′-CTAGCCCCGCAGACACTAGC，反义引物为5′-CCCCGCCTCCTCTTGCTCTGTA。通过比较正反义引物的△△Ct计算miR-132丰度，由于U6 snRNA能在真核生物稳定表达，故使用U6 snRNA作为对照。

1.2.3蛋白质印迹检测大鼠LTP后直接处死，分离海马，使用组织匀浆液匀浆（氯化钠50 mmol/L、三羟甲基氨基甲烷10 mmol/L、二水乙二胺四乙酸二钠1 mmol/L、十二水钒酸钠0.5 mmol/L、氟化钠50 mmol/L、二苯甲烷1 mmol/L、苯基-甲基磺酰氟1 mmol/L），匀浆好的样品再加入4×缓冲液（含8%十二烷基硫酸钠、三羟甲基氨基甲烷200 mmol/L、40%甘油），然后沸水中煮10 min，10 000 r/min、4℃离心10 min，去上清液，用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测待测样品蛋白浓度，取相同上样量在10%浓缩胶和4%分离胶中电泳，并转移到硝酸纤维素膜上，在6%牛血清清蛋白（bovine serum albumin，BSA）溶液中封闭30 min后按照适当的抗体稀释比例孵育，加入二抗并进行显色。

1.2.4尾静脉注射将SD大鼠固定在自制矿泉水瓶中，尾巴从瓶子后方的小孔暴露出来，使用75%乙醇消毒处理后，用头皮针将SB216763（0.2 mg/kg）经尾静脉注射入大鼠血液中，从而抑制大鼠脑内GSK-3β的活性。

1.3统计学处理应用SPSS17.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1CREB Ser129磷酸化及miR-132参与LTP形成HFS诱导LTP后大鼠海马CDEB Ser129位点的磷酸化和miR-132的表达见图1。

2.1.1HFS后两组大鼠动作电位增幅和相对总量表达强直刺激激活CA3～CA1环路后，LTP组大鼠海马动作电位无论是斜率和增幅均较强直刺激前明显增加，而且均高于Con组（图1A、C）；与对照组比较，LTP组动作电位增加（1.70±0.13）倍（图1B），差异均有统计学意义（P＜0.01），表明LTP诱导成功。

图1　HFS诱导LTP后大鼠海马CREB Ser129位点的磷酸化和miR-132的表达

2.1.2蛋白质印迹法和RT-PCR检测CREB Ser129位点的磷酸化及miR-132的表达HFS后，LTP组大鼠CREB在Ser129位点的磷酸化及海马miR-132的表达水平均明显增加，分别较Con组增加（1.80±0.08）倍和（3.60±0.27）倍，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见图1D、E、F。

2.2尾静脉注射SB216763抑制miR-132表达LTP电刺激前给予大鼠尾静脉注射SB216763后，通过HFS发现LTP受抑制，与Con组比较，LTP组动作电位显著降低，海马miR-132的表达和CREB Ser129位点的磷酸化水平明显降低，分别是Con组的（0.54±0.04）倍和（0.10±0.02）倍，差异均有统计学意义（P<0.01）。见图2。

图2　应用SB216763后大鼠海马CREB Ser129位点的磷酸化和miR-132的表达

3　讨论

miRNA与学习记忆的关系已有大量文献报道。miRNA可调节LTP相关蛋白合成，包括N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA）和AMPA［7］。同样，在体外介导LTP也可以调节miRNA的表达［8-9］。研究表明，使用麻醉大鼠在海马齿状回区（dentate gyrus，DG）诱导LTP可以导致miR-132、miR-212表达上调和miR-219a表达下调，而NMDA的活性可以抑制这些miRNA的表达，AMPA的活性可以上调这些miRNA的表达［10］。但有研究发现，在清醒大鼠体内诱导LTP可以下调miRNA的表达，包括miR-132［9］。也有报道指出，在清醒大鼠体内没有发现相关的miRNA有很大改变，包括miR-132［11］。

本研究结果显示，给予麻醉大鼠LTP电刺激后，海马CA1区的miR-132水平明显升高，而使用GSK-3β抑制剂SB216763后，CA1区的miR-132显著降低。表明海马CA1区miR-132的升高可以通过CREB Ser129的磷酸化来调节。

综上所述，CREB Ser129的磷酸化是由GSK-3β介导的，而GSK-3β对学习记忆的巩固和提高有非常重要的作用［12］，表明CREB Ser129位点的磷酸化对于记忆的巩固和提取有重要作用。然而有报道指出，CREB Ser129位点的磷酸化可以降低CREB的活性，该位点的磷酸化所导致CREB活性降低在学习记忆中的作用还不清楚［13］。因此，CREB Ser129位点对于学习记忆的作用还有待进一步探讨。

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［2］Horike N，Sakoda H，Kushiyama A，et al.AMP-activated protein kinase activation increases phosphorylation of glycogen synthase kinase 3beta and thereby reduces cAMP-responsive element transcriptional activity and phosphoenolpyruvate carboxykinase C gene expression in the liver［J］. J Biol Chem，2008，283（49）：33902-33910.

［3］Tully T，Bourtchouladze R，Scott R，et al.Targeting the CREB pathway for memory enhancers［J］.Nat Rev Drug Discov，2003，2（4）：267-277.

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Phosphorylation at serine 129 site of CREB for increasing miR-132 level

Wang Xiang，Hu Jiashao
（Medical School，Jianghan University，Wuhan，Hubei 430056，China）

ObjectiveTo investigate the influence of phosphorylation at serine（Ser）129 site of cAMP-response element binging（CREB）protein on micro RNA-132（miR-132）by activating phosphorylated CREB for the related protein expressing memory obtaining the long term memory.MethodsThe long-term potentiation（LTP）electric stimulation and tail vein injection were adopted to give glycogen synthase kinase-3β（GSK-3β）inhibitor SB216763，the level of CREB phosphorylation in rat hippocampus area was detected by using the Western blot and the miR-132 expression was detected by using RT-PCR.Results

High frequency stimulation at CA3-CA1 neurocircuit could successfully induce LTP，which significantly increased the expression level of phosphorylated CREB Ser 129 in rat hippocampus and miR-132 level；SB216763 could inhibit the GSK-3β activity，thereby inhibited serine 129 phosphorylation of CREB and significantly decreased the LTP slope amplification and reduced the CREB Ser phosphorylation level and miR-132 expression.ConclusionThe phosphorylation of CREB at the serine 129 site could promote the LTP formation by regulating miR-132 expression，the phosphorylation of CREB Ser 129 site regulates the miR-132 expression during the LTP formation process，thus influences the long term memory formation.

Cyclic AMP response element-binding protein；MicroRNAs；Protein-serine-threonine kinases；Phosphotransferases；Glycogen synthase kinase 3；Long-term potentiation；Potentiometry；Memory

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.20.010

A

1009-5519（2016）20-3125-03

王翔（1984-），博士研究生，主要从事神经生物学、阿尔茨海默病的研究。

（2016-07-17）