沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的原核表达、纯化、抗体制备及鉴定

郭睿 刘原君 郑蕾 王生 魏世娟 刘全忠

300052天津医科大学总医院皮肤性病科

沙眼衣原体多形外膜蛋白PmpI的原核表达、纯化、抗体制备及鉴定

郭睿 刘原君 郑蕾 王生 魏世娟 刘全忠

300052天津医科大学总医院皮肤性病科

目的克隆、表达沙眼衣原体多形外膜蛋白I（Pmp I）基因，并进行免疫原性鉴定，分析其生物学特征。方法用生物信息软件分析沙眼衣原体多形外膜蛋白Pmp I的基因序列并预测PmpI蛋白的B细胞抗原表位。以D型沙眼衣原体DNA为模板，PCR扩增PmpI基因N端90～1464碱基序列，构建原核载体进行诱导表达。Ni离子亲合层析柱纯化重组蛋白，制备Pmp I多克隆抗体并用Western印迹法检测其免疫原性。结果对蛋白质的二级结构和柔性区、氨基酸的亲水性、抗原指数和表面可及性预测结果综合分析，推测该蛋白含有8个优势B细胞表位。PCR扩增D型沙眼衣原体Pmp I基因核苷酸序列长度为1 375 bp。成功构建pET28a⁃PmpI原核表达重组体，经诱导表达、亲和层析纯化后获得了相对分子质量为50 000的重组蛋白并制备其多克隆抗体。结论成功克隆并表达了D型沙眼衣原体多形外膜蛋白N⁃Pmp I，为研究该蛋白的生物学功能奠定了一定基础。

沙眼衣原体；细菌外膜蛋白质类；克隆，分子；多形外膜蛋白

沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis，Ct）是一种常见的性传播疾病感染源，尤其在青少年人群中多发［1］，共分为15～19个主要血清型。多形外膜蛋白（polymorphicmembrane protein，Pmp）是衣原体特有的外膜蛋白，包含9个型（PmpA～I），功能可能与宿主细胞的粘附、自我转运、信号转导等有关。Pmp蛋白具有与自我转运蛋白相似的3个功能区域，即N端信号肽、娩出域（passenger domain）和C端易位区（translocation unit）［2］。Pmp蛋白依赖包含多个保守的短重复4肽基序GGA（I，L，V）和FXXN的N端娩出域易位到细菌表面，因此此类蛋白可介导衣原体感染上皮或内皮细胞［3］。本课题组与美国马里兰大学衣原体研究中心合作研究表明，CtPmp I可能是衣原体噬菌体phiCPG1衣壳蛋白Vp1粘附并结合到Ct表面的位点。鉴于此，本实验采用生物信息学方法对Pmp I基因及其编码蛋白的特性及B细胞抗原表位进行预测，以D型Ct为对象，对CtPmp IN端进行表达、纯化及免疫原性研究，为进一步了解噬菌体粘附Ct的机制及作用提供依据。

资料与方法

一、资料

1.基因序列号：19种血清型（A～K，Ba，Da，Ia，Ja，L1，L2，L2a，L3）Ct多形外膜蛋白I全长基因序列基因库登陆号分别为AY299427.1～AY299445.1，其氨基酸序列基因库登陆号分别为AAQ74443.1～AAQ74461.1

2.菌株、质粒、试剂与实验动物：D型CtUW⁃3标准株由美国马里兰大学衣原体研究中心提供。质粒pET⁃28a，菌株E.coliDH5α、BL21（DE3），EasyTaq扩增酶，DNA相对分子质量标准（全式金公司）。高保真扩增酶I⁃5™（美国MCLab公司）。NdeⅠ、SalⅠ核酸内切酶（美国Thermo公司）。T4DNA连接酶（日本Takara公司）。琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒（美国Axygen公司）。D36mm透析袋（截流范围8 000～14 000，北京鼎国生物技术有限公司）。His融合标签蛋白纯化试剂盒（His·Bind Purification Kit，德国Merck公司），实验用新西兰大白兔购自北京市海淀区实验动物养殖中心［合格证号SCXK⁃（京）2011⁃0006］，研究单位动物使用许可证号：SYXK（京）2011⁃0018。

二、方法

（一）CtPmp I基因及其编码蛋白的生物信息学分析：

1.Pmp I同源家族成员多序列比对［4］：在基因库中检索出包含19种Ct不同血清型的PmpI全长基因序列，并用Megalign软件Cluster方法（参数选择Default）进行核酸序列比对分析。

2.信号肽预测：用SignalP⁃4.1 gram⁃predictions软件，对19种Ct不同血清型Pmp I基因的氨基酸序列分别进行信号肽分子的预测。

3.Pmp I氨基酸保守区预测：用http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/预测氨基酸序列保守区，参数设置：Data source：CDSEARCH/cdd v3.14，E⁃Value cut⁃off：0.01。

4.Pmp I二级结构及柔性区域预测［5⁃7］：用LaserGene软件中的Protean程序，分别按Karplus⁃Schulz、Chou⁃Fasman和Garnier⁃Robson方案，分析Pmp I二级结构中的柔性区域、转角、无规则卷曲易形成区。

5.Pmp IB细胞抗原表位预测［8⁃10］：用LaserGene软件中的Protean程序，按Kyte⁃Doolittle方案预测Pmp I氨基酸的亲水性，按Jameson⁃Wolf方案预测抗原指数，利用Emini方案预测蛋白质的表面可及性。3种方案指数均较高的区域（亲水性指数＞1.0；抗原指数＞1.5；表面可及性指数＞3.7）同时其内部或附近又为柔性区，则B抗原表位很有可能位于或邻近其区段。

（二）D型Ct多形外膜蛋白N⁃Pmp I的克隆、表达、纯化及免疫原性鉴定：

1.引物设计与合成：根据基因库提供的CtD型UW⁃3标准株Pmp I基因，通过软件分析去除信号肽序列，扩增N端90～1464碱基序列，共1 375个碱基。引物由上海捷瑞生物工程有限公司北京分公司合成，序列如下：上游引物P1（下划线为NdeⅠ酶切位点）5′⁃GGAATTCCATATGGAAACCGCCCTCCT CAC⁃3′，下游引物P2（下划线为SalⅠ酶切位点）5′⁃ACGCGTCGACAGAAAGGTTAGGGGCGTGG⁃3′。

2.rpET28a⁃Pmp I重组质粒的构建：取50μl提纯的Ct，按试剂盒说明提取目的基因作为模板。模板1μl，引物各2μl，I⁃5™（高保真扩增酶）25μl，灭菌蒸馏水20μl，共50μl体系作为PCR反应体系，98℃2min预变性；98℃10 s，60℃10 s，72℃20 s，30个循环，72℃延伸5min为反应参数进行PCR扩增目的基因片段。扩增产物电泳后切胶回收纯化，操作步骤按Axygen胶回收试剂盒说明书。将PCR产物纯化后，用NdeⅠ、SalⅠ双酶切，将酶切后的Pmp I基因在T4DNA连接酶作用下连接pET⁃28a载体，构建重组质粒。反应体系组成如下：10×T4缓冲液1μl，pET⁃28a 1μl，Pmp I基因7μl，T4 DNA连接酶1μl。反应条件为22℃，2 h。将连接产物转化感受态菌株E.coliDH5α后，涂布于含卡那霉素抗性LB平板，37℃过夜培养。挑单克隆于4ml卡那霉素抗性LB液体培养基中过夜，次日抽提质粒，NdeⅠ、SalⅠ双酶切鉴定，基因片段大小正确的送北京金唯智公司测序。

3.pET28a⁃PmpI重组蛋白的诱导表达及纯化：将测序正确的阳性质粒转化BL21（DE3），涂卡那霉素抗性LB平板，放置于37℃培养箱过夜培养。挑取转化成功的单克隆菌落接种于10m l卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃摇菌过夜。次日将菌液加入400m l卡那霉素抗性LB液体培养基中，37℃摇菌培养至A600为0.5～0.8之间，加入终浓度0.5mmol/L的IPTG（异丙基⁃β⁃D⁃硫代半乳糖苷），37℃诱导培养3 h，同时设未诱导组及阴性对照组。收集菌体后加入PBS重悬并加入终质量浓度为4 g/L的溶菌酶与终浓度3%的Triton⁃X⁃100（聚乙二醇辛基苯基醚），冰育15min。超声碎菌后低温离心，收集上清液与沉淀分别SDS⁃PAGE凝胶电泳。用His融合标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，步骤按说明书操作，纯化后进行SDS⁃PAGE凝胶电泳鉴定。将上述收集的纯化蛋白装入D36mm透析袋中，4℃下透析到Tris⁃NaCl缓冲液（50mmol/L Tris，150mmol/LNaCl，4mmol/LGSH，0.4mmol/LGSSG，0.4mol/L L⁃精氨酸，2 mmol/L EDTA，pH 8.0）中复性约24 h后，将蛋白最终透析于储存液0.01mol/L PBS（pH7.2～7.4）6～8 h。结束后，上清液用0.22μm滤器过滤后分装，将复性蛋白进行定量后将其冻存至-80℃。

4.兔抗Pmp I多克隆抗体的制备、纯化及其鉴定：以此纯化复性后蛋白为抗原，加弗氏佐剂免疫2只新西兰兔，各取1m l血清进行Protein G纯化，并且通过BCA蛋白定量法测定抗体浓度，ELISA检测新西兰白兔的免疫滴度，并通过Western印迹鉴定免疫原性。

结果

一、CtPmp I基因及其编码蛋白的生物信息学分析

1.Pmp I基因序列的比对分析：经Cluster方法比对发现，Ct各型Pmp I基因非常保守，序列间的一致性在99.0%以上。基于此结果，本研究选取D型Ct Pmp I蛋白的氨基酸序列作为B抗原表位预测分析对象。D型Pmp I氨基酸序列登陆号为AAQ74447.1。

2.信号肽预测：鉴于上述多序列比对发现，同源序列间的相似性极高，而且前25个氨基酸完全一致。经过所有19个血清型PmpI氨基酸序列的信号肽预测分析，结果均为N端前25个氨基酸为预测信号肽区域，其序列为MRPDHMNFCCLCAAILSSTAVLFGQ。

3.蛋白保守区预测：由于19种血清型Ct Pmp I蛋白序列的高度保守性，其氨基酸保守区预测结果是一致的。通过NCBI网站预测到Pmp I蛋白的C端易位区可能位于607～878氨基酸。

4.Pmp I二级结构及其柔性区域预测：综合分析Pmp I蛋白娩出域（除信号肽和C端易位区）的二级结构柔性区，位于N端的26～28、37～39、73～74、111～114、117、124～126、132～135、145～148、170～176、187～189、202～204、215～216、225～226、228～231、240～243、279～280、287～301、308、316～319、321～322、346～347、359～362、366、368、376～379、390～391、399、410、438～441、443、496～499、514、531～533、542～544、551～553、564～566、571～572、585～587。

5.Pmp IB细胞抗原表位预测：Pmp I娩出域中极有可能的B抗原表位区段位于N端的26～29、36～39、110～118、120～128、131～136、170～177、228～229、239～246。

二、D型Ct多形外膜蛋白N⁃PmpI的克隆、表达、纯化及免疫原性鉴定

图1 Pmp I基因PCR扩增结果M：标准参照物；1：PCR扩增产物

1.Pmp I基因扩增：取5μl PCR产物经1%琼脂糖电泳，在约1 500 bp位置可见一明显特异性条带，片段大小与预期一致（图1）。

2.pET28a⁃Pmp I重组表达质粒的构建与鉴定：经限制性核酸内切酶NdeⅠ、SalⅠ双酶切后，1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，pET28a⁃Pmp I重组质粒被酶切为约1 500 bp和5 500 bp两个片段（图2），证明

图2重组质粒pET28a⁃Pmp INdeⅠ、SalⅠ双酶切验证结果M：标准参照物；1：pET28a⁃PmpI重组质粒双酶切重组质粒构建成功。对重组质粒进行序列测定分析并与基因库中Ct D型UW⁃3标准株Pmp I基因N端序列（90～1 464 bp）（登陆号：AY299431.1）对比分析表明，插入的Pmp I基因片段没有碱基缺失、突变，插入方向及读码框均正确无误，说明重组表达质粒构建成功。

3.重组蛋白的表达、纯化：将重组质粒转化至E.coliBL21（DE3）表达宿主菌，挑选阳性重组菌进行IPTG诱导表达。通过SDS⁃PAGE电泳分析发现其表达产物在相对分子质量50 000处有一特异性条带，与蛋白预期相对分子量大小相符，而诱导前无此条带，说明重组工程菌株构建成功。诱导温度37℃，时间为3 h时蛋白表达量最大，且表达的重组蛋白N⁃Pmp I主要以包涵体形式存在于沉淀中（图3、4）。将纯化的包涵体蛋白透析复性后采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度为1.2 g/L。

4.重组蛋白多克隆抗体鉴定及浓度测定：Western印迹结果显示，兔抗Pmp I多克隆抗体可特异性结合重组Pmp I蛋白，而不识别对照组BSA蛋白（图5）。ELISA结果显示，此多克隆抗体滴度为1∶100 000。经测定，此多抗浓度为2.7 g/L。

图3重组质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中0.5 mmol/L IPTG不同时间、温度诱导表达的SDS⁃PAGE结果M：标准参照物；1：未诱导对照；2：37℃诱导3h；3：15℃诱导过夜；4：28℃诱导过夜

讨论

蛋白质具有许多功能，对于这些功能的预测仍然是生物物理学与生物信息学的主要挑战之一。随着新技术的进步，X射线晶体衍射、核磁共振NMR技术以及冷冻电子显微镜技术等为蛋白质结构功能解析提供了广阔的平台。但由于X线衍射与NMR均存在样品纯度与分子量大小、分辨率等局限，使得蛋白质结构预测应运而生，并逐步成为结构生物信息学研究领域的重点。在蛋白相应晶体结构尚不明晰的情况下，通过生物信息工具分析二级结构及抗原表位，推测蛋白功能，逐渐成为蛋白功能学研究的有效手段。本实验成功预测了PmpI蛋白的理化性质、二级结构及B抗原表位，分析序列中蕴含的结构功能信息，将会推动衣原体Pmp蛋白相关功能学研究的进展。

Ct的PmpA～I蛋白氨基酸序列及相对分子质量都不相同，表现为多形性，其平均遗传距离在0.1%（PmpA）～7%（PmpF）之间。Gomes等［11］推测，pmp基因在结构或功能上的此种变化会促进抗原及粘附受体多样性，可能与衣原体免疫逃逸和不同组织嗜性相关。近年研究显示，Pmp蛋白可能在诱导机体CD4＋T细胞产生保护性免疫的过程中发挥重要作用［12］，从而成为衣原体疫苗的研究方向。Tanzer和Hatch［13］研究表明，所有的Pmp蛋白在Ct感染后2 h均开始表达，感染12 h后表达开始上调，此与网状体发育时间一致，表达量在36 h达到最高峰，其中PmpF蛋白表达量最高。Stothard等［14］通过DNA测序发现，在9种Pmp蛋白中，Pmp I基因序列最为保守，在15种Ct的血清型中只有不超过1%的Pmp I基因序列有所不同。本实验Pmp I同源家族成员多序列比对与此结论接近。氨基酸序列和空间结构高度保守的蛋白一般能稳定遗传且难以替代，因此推测此高度保守的Pmp I基因所编码Pmp I蛋白

图4重组N⁃Pmp I蛋白包涵体纯化结果M：标准参照物；1：8 mol/L尿素溶解离心后上清液；2：8 mol/L尿素溶解上清液同IDAHis·Bind树脂孵育后流出液；3～9：不同咪唑浓度（50、100、200、400、600、800、1 000mmol/L）的蛋白洗脱液（目的蛋白）

图5重组蛋白多克隆抗体的Western印迹检测结果1：未纯化的PmpI蛋白；2：纯化的Pmp I蛋白；3：对照组BSA蛋白可能具有重要功能。

刘原君等［15］通过Far⁃Western印迹技术研究证实，衣原体噬菌体phiCPGl衣壳蛋白Vp1能特异结合D型Ct标准株的外膜蛋白Pmp I，而不结合其他多形外膜蛋白（PmpA～H）及主要外膜蛋白（MOMP蛋白）。因此提出，Vp1蛋白可能通过与Ct外膜蛋白Pmp I结合从而特异性地与Ct结合发挥其功能。通过研究Pmp I蛋白的自我转运与孔道形成机制以及Pmp I蛋白粘附噬菌体前后的构象改变，将会促进对衣原体噬菌体作用机制的探究，有望使噬菌体治疗成为解决难治性衣原体感染的有效手段。

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第八届泛亚太皮肤屏障功能研究学会年会通知

第八届泛亚太皮肤屏障功能研究学会年会定于2017年4月26日与美国皮肤研究学会（SID）年会同期召开。会议地点是Oregon Convention Center，777NEMartin Luther King Jr Blvd.Portland,Oregon 97232，United States。

一、投稿要求

①投稿内容：没正式发表过、与表皮通透屏障功能相关的基础和临床研究论文；②投稿方式：按SID会议要求写英文摘要（https://sidnet.site⁃ym.com/page/AnnualMeeting），请投稿至Joan.wakefield@va.gov，收件人Ms.JoanWakefield。截稿日期2017年1月4日；③会议交流形式：特邀讲演、大会发言、壁报交流。

二、会议注册

如果您注册参加SID会议可以免费参加本次会议，否则现场支付注册费，每位50美元，学生和住院医师每位25美元。

联系人：Ms.Joan Wakefield（Joan.wakefield@va.gov），蔄茂强（mqman@hotmail.com）。有关会议其他事宜可查询https://sidnet.siteym.com/page/AnnualMeeting和中华皮肤科杂志网站https://www.pifukezazhi.com的通知栏目。注册表请用英文填写，内容包括姓名、职位、Email、工作单位、提交论文题目、是否注册SID会议、会议交流形式是口头发言还是壁报交流。

Polym orphic m embrane protein I ofChlamydia trachomatis:prokaryotic expression,purification,antibody preparation and identification

Guo Rui,Liu Yuanjun,Zheng Lei,Wang Sheng,WeiShijuan,Liu Quanzhong

DepartmentofDermatology and Venereology,Tianjin MedicalUniversity GeneralHospital,Tianjin 300052,China

Liu Quanzhong,Email:liuquanzhong@medmail.com.cn

Objective To clone and express the polymorphicmembrane protein I（Pmp I）gene ofChlamydia trachomatis（Ct）,and to assess the immunogenicity and biological characteristics of PmpI.M ethods A bioinformatic software was used to analyze the sequence of the PmpIgene of Ct,and to predict B cell epitopes in PmpI.With Ct serovar DDNA as the template,PCRwas performed to amplify the N⁃terminal region（from position 90 to 1464）of the PmpIgene,whichwas cloned into a prokaryotic expression vector pET28a to express the recombinant protein Pmp I.A Ni⁃ion affinity chromatography column was used to purify the recombinant protein,which was used to immunize New Zealand rabbits for preparation of polyclonal antibodies.Western blot analysis was conducted to evaluate the immunogenicity of this protein.Results A comprehensive analysis was carried out on the secondary structure,flexible regions,hydrophilicity plot,antigenic index and surface probability plot of the protein,which suggested that PmpIhad 8 dominant B⁃cell epitopes.The product of PCR targeting the Pmp Igene of Ct serovar D showed a total length of1375 bp.The recombinantprokaryoticexpression vectorpET28a⁃PmpIwassuccessfullyconstructed.A recombi⁃nantproteinwith a relativemolecularmassof approximately 50 000 was successfully expressed after isopropylβ⁃d⁃1⁃thiogalactopyranoside（IPTG）induction,and purified by affinity chromatography.Polyclonal antibodies against the recombinant protein were successfully prepared.Conclusion The N⁃Pmp I protein of Ct serovar D is cloned and expressed successfully,layinga foundation for further studieson itsbiological functions.

Chlamydia trachomatis;Bacterial outer membrane proteins;Cloning,molecular;Polymorphic membrane protein

刘全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.0412⁃4030.2016.11.010

国家自然科学基金（31370211）

Fund program:NationalNatural Science Foundation ofChina（31370211）

2016⁃04⁃08）

（本文编辑：吴晓初）