骨桥蛋白对大鼠小肠隐窝上皮细胞生物学性状的影响

潘　杰　王晨习　郎宇璜　刘　敏　杨丽卡　陈凤媛△

(1复旦大学附属上海市第五人民医院普外科, 2消化内科,3急诊科　上海　200240)



骨桥蛋白对大鼠小肠隐窝上皮细胞生物学性状的影响

潘杰1王晨习2郎宇璜3刘敏2杨丽卡2陈凤媛2△

(1复旦大学附属上海市第五人民医院普外科,2消化内科,3急诊科上海200240)

目的观察骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对大鼠小肠隐窝上皮细胞(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)分化、增殖、迁移等生物学性状的影响。方法分别采用相差显微镜、细胞贴壁率检测、噻唑蓝比色法、划痕实验、Western blot和ELISA法,观察不同浓度OPN对IEC-6细胞增殖、分化和迁移能力的影响,并从鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)表达变化和炎性反应角度,探讨其可能的作用机制。结果经不同浓度的OPN处理后,IEC-6细胞形态、贴壁率和增殖率均未见明显变化。OPN能促进IEC-6细胞的移行功能,且OPN浓度越高细胞迁移速度越快。与低浓度或高浓度OPN相比,适当浓度的OPN能促进IEC-6细胞内ODC1蛋白表达(0.1 μg/mL和1.0 μg/mL OPN)和细胞内炎性反应(0.05 μg/mL OPN)。结论OPN能促进IEC-6细胞的移行功能,从而促进损伤黏膜早期修复,其机制可能与特定浓度的OPN能促进细胞内ODC1蛋白的表达和损伤IEC-6细胞的炎性反应有关。

骨桥蛋白;肠上皮细胞;细胞增殖;细胞迁移;大鼠

骨桥蛋白(osteopontin,OPN)是一种分泌型的磷酸化蛋白质,广泛分布于组织和细胞内,参与了包括骨代谢、慢性炎症、免疫反应、组织修复、肿瘤生长转移等在内的多种生命现象[1]。Brown等[2]最早描述了OPN在消化道上皮细胞和非上皮细胞中的表达,正常情况下OPN广泛分布于消化道的上皮细胞,特别是腔表面上皮细胞表面的多糖-蛋白质复合物(多糖包被)和细胞外基质中,敲除OPN基因的小鼠不能维持肠黏膜屏障的完整性[3],OPN参与了腔道表面物质的屏障功能,在消化道的固有免疫和获得免疫中均发挥了重要作用[2,4]。我们以往的研究发现,在炎症性肠病患者的结肠组织中,OPN在受损结肠渗出细胞中的表达增加,而在结肠上皮细胞中OPN表达下调[5]。目前尚不知OPN是否参与受损肠黏膜的修复过程,故本实验采用大鼠小肠隐窝上皮细胞(intestinal epithelial cells-6,IEC-6)为研究对象,观察OPN对IEC-6细胞增殖、分化和移行的影响,并从鸟氨酸脱羧酶(ornithine decarboxylase,ODC)表达变化和炎性反应角度,探讨其可能的作用机制。

材 料 和 方 法

细胞培养IEC-6细胞(美国ATCC公司)培养于DMEM培养液(90% DMEM培养液+10%胎牛血清+100 U/mL青霉素+100 U/mL链霉素+0.1 U/mL胰岛素)置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中,次日换液,细胞生长至90%融合时,用0.25%胰酶消化,传代。第15～20代细胞用于实验,此时的细胞生物学功能和特性未发生明显变化。

细胞干预与分组IEC-6细胞随机分为6组,分别为对照组和不同浓度OPN干预组,OPN浓度分别为0.01、0.05、0.1、1和5 μg/mL,对照组加入等量PBS[6]。

OPN对IEC-6细胞的形态的影响取对数期生长的IEC-6细胞,调整细胞浓度为1×106个/mL接种于6孔板(1×104个/孔),孵育24 h。加入不同浓度的OPN与IEC-6细胞孵育,对照组加入等量PBS,24 h后弃上清液,相差显微镜观察IEC-6细胞的形态及内部结构改变。

OPN对IEC-6细胞贴壁率的影响取对数期生长的IEC-6细胞,调整细胞浓度为5×106个/mL接种于6孔板(1×104个/孔),孵育24 h后弃上清液,将贴壁细胞用胰酶消化后计数。公式计算:贴壁率(%)=(贴壁细胞数/种植总数)×100%。

OPN对IEC-6细胞增殖影响的检测采用噻唑蓝(MTT,美国Sigma公司)比色法,收集对数期生长的IEC-6细胞,调整细胞浓度为5×102/200 μL,接种于96孔培养板,每孔100 μL,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育24 h,各组加入不同浓度的OPN,每孔100μL,对照组加入等量PBS,每组设置5个复孔。24 h后弃上清液,每孔加入20 μL MTT(用pH值7.4～7.5的PBS缓冲液配制成浓度为0.5% MTT的溶液,即5 mg/mL),继续孵育4 h。小心吸去孔内培养上清液,每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO),置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解。用酶联免疫检测仪在570 nm波长处测定各孔吸光度(D),同时设置调零孔(培养基、MTT、DMSO)。

OPN对IEC-6细胞迁移能力的影响取对数生长期细胞,以5×102/200μL浓度接种于6孔板,置于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中孵育,待长成单细胞层后,用移液器枪头(规格200 μL)划出缺损区,造成IEC-6细胞机械损伤,立即更换培养液,用PBS冲洗细胞表面2次,以去除细胞残骸和碎片。各组加入不同浓度OPN,对照组加入等量PBS,每组设置3个复孔。分别在加入OPN后0、4、8、12、16、20、24、28、32 h用倒置显微镜下拍照,观察细胞迁移情况,采用图像分析仪对缺损区随时间的变化进行定量分析。

Western blot法检测ODC1蛋白表达各组加入不同浓度OPN,对照组加入等量PBS,与IEC-6细胞孵育24 h。去除培养液,用PBS清洗1遍,每孔加入100 μm Western及IP细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司)提取总蛋白,14 000×g离心5 min,取上清。采用BCA法检测蛋白浓度。SDS-PAGE电泳分离蛋白(每组设2个复孔,每份样本加总蛋白20 μg,分离胶电压60 V,浓缩胶电压120 V)。半干法转至PVDF膜(恒压15 V,90 min)。TBST中振荡洗膜3次(每次15 min),用含5% BSA的TBST溶液室温封闭1.5 h。兔多克隆ODC1抗体(1:500)室温孵育1.5 h。用TBST洗涤3次(每次15 min)。山羊抗兔辣根过氧化物酶二抗(1∶10 000)室温孵育1 h。TBST洗涤4次(每次10 min)。加显色液,采用LAS3000成像系统(日本FUJIFILM公司)进行摄像分析。

ELISA法检测骨髓过氧化物酶(MPO)水平取对照组和不同浓度OPN干预组细胞的总蛋白,根据试剂盒说明书检测骨髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)水平。

结　　　果

OPN对IEC-6细胞形态的影响相差显微镜下观察IEC-6细胞形态学变化,IEC-6细胞为上皮样细胞群体,多为不规则多角形,边界清楚,细胞核较大,呈卵圆形,细胞间相互连接,呈现旺盛的增殖活性,贴壁生长。不同浓度OPN干预组与对照组相比IEC-6细胞无明显细胞形态学改变(图1)。

OPN对细胞贴壁率的影响对照组和不同浓度OPN干预组的细胞贴壁率的具体值见表1。与对照组相比,不同浓度OPN对IEC-6细胞迁移率的影响无明显统计学差异。

OPN对IEC-6细胞增殖的影响对照组和不同浓度OPN干预组IEC-6细胞MTT的具体值见表1。对照组相比,不同浓度OPN对IEC-6细胞增殖率的影响无明显统计学差异。

表1　OPN对IEC-6细胞贴壁率、增殖率和MPO的影响

vs.Control group,(1)P<0.05.MPO:Myeloperoxidase.

OPN对IEC-6细胞迁移的影响对照组与不同浓度OPN干预组IEC-6细胞迁移情况如图2所示。5 μg/mL OPN处理培养的小肠上皮细胞迁移速度较其他浓度OPN组明显增快,且差异有统计学意义(P<0.05)。

图2OPN对IEC-6细胞迁移的影响(×40)

Fig 2Effects of OPN on migration of IEC-6 cells (×40)

OPN对IEC-6细胞ODC1蛋白表达的影响Western blot检测发现IEC-6细胞中可见ODC1蛋白的表达,ODC1蛋白主要条带定位于53 KD,内参GAPDH条带定位于36 KD。与对照组相比各OPN干预组的ODC1蛋白表达增强,其中OPN 1.0和0.1 μg/mL干预组的ODC1蛋白表达最强,而OPN 0.01、0.05和5.0 μg/mL干预组的ODC1蛋白表达较弱(图3)。

OPN对IEC-6细胞炎性反应的影响对照组和不同浓度OPN干预组MPO蛋白活性量值具体数如表1所示。与对照组相比,0.05 μg/mL OPN干预组的MPO蛋白活性量表达最高(P<0.05)。

讨　　　论

经不同浓度的OPN处理后,OPN能促进IEC-6细胞的移行功能,从而促进细胞缺损区的修复,且OPN浓度越高细胞迁移速度越快,而IEC-6细胞形态、贴壁率和增殖率均未见明显变化。我们也发现,OPN能增加IEC-6细胞内ODC1蛋白的表达,同时还能促进损伤后IEC-6细胞内的炎性反应,这两种现象在适当浓度的OPN处理IEC-6细胞时比低浓度或高浓度OPN处理细胞时更明显。

胃肠道黏膜经常受到机械性和化学性(特别是强酸碱物质)的损伤,并时常遭受有害物质的攻击,与其他器官相比受损机会更多。因此,在长期的进化过程中,胃肠道形成了一套完善的自我保护机制,以修复受损的黏膜。胃肠黏膜的修复依赖于正常细胞增殖和移行,特别是作为快速修复机制的细胞迁移,在胃肠黏膜细胞的保护中具有更为重要的意义[7-8]。当上皮细胞连续性受到破坏后,细胞在损伤后数分钟内收缩创口,细胞膜的突起部分开始延伸,跨过损伤的上皮,它不依赖于细胞再生,但需要上皮细胞高度协调的自发性应答反应[9]。OPN参与细胞存活、炎性反应的发展和创伤修复,提示可能影响黏膜组织的修复[4]。我们以往的研究发现,炎症性肠病患者结肠上皮细胞中OPN的表达下降[5],Gassler等[10]也发现活动期克罗恩病患者末端回肠溃疡性病变附近肠上皮细胞中OPN表达缺失,化生隐窝中OPN呈轻度过表达。此种OPN表达的不一致性可能与克罗恩病的慢性病变过程有关,肠上皮细胞中OPN表达下调可能导致黏膜屏障受损,并促进炎症进程[10]。本研究的体内细胞损伤实验模型中,经OPN处理后,细胞缺损区的修复明显快于对照组,说明OPN可促进IEC-6细胞的移行,从而促进损伤肠黏膜的修复,且IEC-6细胞迁移速度随OPN浓度增高而增快。

图3OPN对IEC-6细胞ODC1蛋白表达的影响

Fig 3Effects of OPN on ODC1 protein levels in IEC-6 cells

与细胞迁移密切相关的分子是多胺,包括精胺、亚精胺和腐胺,这些分子存在于多种饮食中,也可在胃肠道黏膜中合成,当细胞中多胺水平由于抑制剂、突变或转染而下降后,则细胞分裂、分化及移行等均会被严重抑制。实验性结肠炎模型动物予以多胺可加速细胞迁移,加快黏膜修复,而抑制多胺合成会减慢细胞迁移[11]。研究表明,ODC是多胺生物合成的重要酶,是促进DNA复制所需,而多胺对正常黏膜生长和损伤后黏膜修复具有重要作用,细胞内多胺水平则由ODC调节。在静息细胞中ODC的量很少,但当暴露于营养物质,例如激素、药物、组织再生刺激物和生长因子时其活性可在数小时中提高7倍;吸烟会降低ODC活性,延缓溃疡修复,而这一过程又会被给予多胺所逆转[12]。我们的研究发现,各OPN干预组的ODC1蛋白表达均较对照组增强,其中以0.1 μg/mL和1.0 μg/mL OPN干预组的ODC1蛋白表达最强,并非随OPN浓度的增加而加重;而本研究中的划痕试验提示,OPN浓度越高对IEC-6细胞移性功能的促进越明显,说明仍有其他机制参与促进IEC-6细胞的移行,尚待进一步研究。

OPN又称为早期T淋巴细胞活化因子1,在局部炎症中,它是免疫细胞募集及启动Th1细胞免疫的关键细胞因子[1]。我们以往的研究发现[5],OPN介导的Th1免疫反应参与了小鼠结肠炎的免疫反应,OPN可促进Th1细胞因子的表达,但抑制Th2细胞因子的表达,对机体Th1/Th2细胞分化的平衡调节有着重要的作用。多种组织和细胞可表达OPN,包括肠上皮细胞和免疫细胞,OPN在肠道固有免疫和获得免疫中起重要作用。Toyonage等[13]发现,肠道炎症早期,肠上皮细胞是OPN的主要来源,此时OPN产生增加,有利于巨噬细胞募集。Toyonage等[13]还发现,低剂量的OPN(1、10和100 ng/mL)可以促进巨噬细胞的吞噬功能,而1000 ng/mL OPN对巨噬细胞的吞噬功能无明显促进作用。Heilmann等[14]在实验中也有类似的发现,低剂量OPN(100 ng/mL)可以增强人巨噬细胞吞噬E.coli的能力,而高剂量OPN(500 ng/mL)却无此功能。本研究通过划痕实验造成IEC-6细胞损伤,在损伤修复过程中仅在OPN浓度为0.05 μg/mL时检测到MPO的水平明显增加,过低或过高OPN浓度干预组的MPO水平增加并不明显。说明此时IEC-6细胞的炎性反应可能有助于对抗损伤反应,有利于损伤修复。

本研究发现,经不同浓度的OPN处理后,IEC-6细胞迁移功能增强,而在这些浓度的OPN作用下,IEC-6细胞的形态、贴壁率和增殖率均未见明显变化。对于细胞增殖或分化影响的观察时间往往需要1周、数周或更长时间,而我们的实验尚未观察这么长时间,已经可以发现OPN能增强IEC-6细胞迁移的功能,提示OPN可能并非通过促进细胞增殖或分化来促进黏膜修复,OPN在促进受损肠上皮细胞早期重建中的主要机制可能为促进细胞迁移能力。但随着作用时间的延长,OPN是否会对IEC-6的增殖与分化产生影响,仍需进一步研究。另外,IEC-6具有正常的未分化的肠上皮隐窝细胞的特征,因而广泛用于肠上皮细胞损伤的相关研究。本研究仅就OPN对IEC-6细胞功能的影响进行了研究,而OPN是否会对肠上皮细胞产生同样作用,仍需用消化系统其他细胞系或原代细胞分离的细胞来验证。

综上所述,OPN能促进IEC-6细胞的移行功能,从而促进损伤黏膜早期修复,其机制可能与特定浓度的OPN能促进细胞内ODC1蛋白的表达和损伤IEC-6细胞的炎性反应有关。

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E-mail:cfy429@163.com

The effect of osteopontin on the biological characteristics of intestinal epithelial cells in rats

PAN Jie1, WANG Chen-xi2, LANG Yu-huang3, LIU Min2, YANG Li-ka2, CHEN Feng-yuan2△

(1Department of General Surgery,2Department of Gastroenterology,3Department of Emergency, Shanghai Fifth People’s Hospital,Fudan University,Shanghai 200240,China)

ObjectiveTo investigate the effect of osteopontin on rat intestinal epithelial cells differentiation,proliferation and migration.MethodsBy using phase contrast microscope,cell adhesion rate detection,MTT,scratch test,Western blot and ELISA,we observed the function of different concentrations of OPN on IEC-6 cells proliferation,differentiation and migration.Then we explored its possible mechanism from the difference on ornithine decarboxylase (ODC) expression and inflammation.ResultsThe morphology,adhesion rate and proliferation rate of IEC-6 cells had no significant change after treated with different concentrations of OPN.Interestingly,we found OPN could promote the migration of IEC-6 cell with higher concentrations.An appropriate concentration of OPN could promote the expression of ODC1 protein (0.1 μg/mL and 1.0 μg/mL OPN) and intracellular inflammation (0.05 μg/mL OPN) in IEC-6 cells.ConclusionsOPN could promote the migration of IEC-6 cells by promoting the expression of ODC1 proteins and inflammatory response.

osteopontin;intestinal epithelial cells;cell proliferation;cell migration;rat

Q291

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2016.05.012

2016-01-27;编辑:王蔚)

*This work was supported by Scientific Research Foundation of Health Bureau of Minhang District,Shanghai (2011MW01).

上海市闵行区卫生局科研课题(2011MW01)