基于二维荧光相关谱的多环芳烃重叠峰解析

孙雪杉　杨仁杰　董桂梅　周长宏　杨延荣　 张伟玉

( 天津农学院工程技术学院, 天津 300384)



基于二维荧光相关谱的多环芳烃重叠峰解析

孙雪杉杨仁杰*董桂梅周长宏杨延荣 张伟玉

( 天津农学院工程技术学院, 天津 300384)

以激发波长为外扰，基于二维荧光相关谱技术对蒽芘混合溶液中重叠的荧光峰进行有效解析。采集了蒽、芘单组份无水乙醇溶液的激发谱，选择了蒽和芘荧光强度单调变化的5个激发波长：270nm、320nm、325nm、330nm和340nm。在此基础上，采集浓度为5×10-5g/L蒽芘无水乙醇混合溶液在5个激波长下的荧光谱，并以选择的激发波长为外扰，构建同步和异步二维荧光相关谱。结果表明：在同步谱上出现5个较强的自相关峰，位置分别在369 nm、379 nm、391 nm、400 nm和424 nm处；依据未被覆盖的蒽在424nm的处荧光与各波长处荧光交叉峰的正负，指出379 nm和400nm处的荧光峰来自混合溶液中的蒽，而369 nm和391 nm处的荧光峰来自混合溶液中的芘。同时，又根据异步二维荧光相关谱交叉峰的有无，进一步确认和验证了混合溶液中各荧光峰的来源。

二维荧光相关谱蒽芘无水乙醇

多环芳烃(PAHs)是两个或两个以上苯环以及稠环和非稠环连接在一起的化合物。PAHs在环境中无处不在，许多PAHs具有致癌性、致畸性、致突变性，并且具有生物累积性，能长期留存在环境中，因此对多环芳烃的检测已得到很多国家的重视。其中，美国环保暑已将16种多环芳烃列为优先控制的污染物。近年来，雾霾频发，“PM2.5”猖獗，北京、天津等城市经常被雾霾笼罩，人们的健康受到威胁。让人们谈之色变的“PM2.5”，其主要成分之一就是PAHs，因此寻求一种快速、精确、便捷的检测PAHs的方法已成为环保部门急需解决的中重大问题之一。

由于环境中的PAHs多处于复杂体系中，且含量较低，给PAHs的分析带来一定的困难。目前，已经有不少研究多环芳烃的方法，如气相色谱法、高效液相色谱法、气质联用技术、超临界流体层析色谱等[1]，这些方法多是将环境样品经过复杂的前处理进行分离提纯，再进行分析。操作繁琐，且需要大量的有机试剂，费时费力，因此开发一种简便快速检测环境中多环芳烃的方法一直是研究者们研究的焦点。

荧光光谱是光谱分析中灵敏度高，选择性较好的分析方法，已经被广泛的应用于环境中多环芳烃定性定量分析[1-4]。但由于大部分多环芳烃的激发和发射波长非常接近，特征荧光峰相互重叠，严重制约了荧光分析法的选择性。蒽和芘是美国EPA推荐优先控制的16种多环芳烃中的两种。王晗[3]，蔡宗群[4]等指出蒽、芘混合溶液常规一维谱中荧光峰相互重叠，基于恒波长同步荧光光谱技术对混合溶液中蒽和芘重叠的荧光峰进行解析。虽然同步荧光光谱技术相对于常规的荧光谱，在灵敏度和选择性上都有所提高，但多组分的PAHs特征荧光峰重叠现象仍然很严重，而且对于最佳Δλ和ΔE的选择，需要连续不断扫描尝试，且时间较长。

与常规一维谱相比，二维相关谱具有高光谱分辨率、高选择性和高图谱解析能力，已被广泛的应用于物理、化学、材料、生物、医学、食品等各个领域[5，6]。近年来，作者所在的课题组将二维相关谱技术应用在乳制品质量检测中，取得阶段性成果[7-11]。将二维相关谱技术和荧光光谱技术相结合—二维相关荧光光谱技术，可以有效地解决常规荧光谱的局限性。余婧等[12]对二维相关荧光光谱技术的操作性和应用进行了系统阐述，并与普通一维荧光光谱比较，说明了二维相关荧光光谱技术的优势。田萍等[13，14]采用二维相关荧光光谱技术对不同种类的食用植物油进行有效鉴别，指出二维相关荧光光谱技术在食用植物油的种类识别及掺假鉴别中具有广阔的应用前景。关娜和等[15]设计并配置了9个蒽、芘混合溶液，以浓度为外扰，构建二维相关荧光谱，实现蒽芘混合溶液中重叠荧光峰的解析。Nakashima等[16，17]采用二维荧光相关谱研究了多环芳烃的荧光特性，指出对于严重重叠的复杂体系，传统荧光谱无法分辨的荧光峰在相关谱中则分辨得相当清楚。

本实验以激发波长为外扰，研究蒽芘混合溶液的荧光特性，对蒽芘重叠的荧光峰进行有效解析，为复杂环境多环芳烃的检测提供实验和理论基础。

1　实验仪器与材料

仪器：荧光分光光度计LS-55(美国PerkinElmer公司)，脉冲氙灯，1 cm带塞石英比色皿。荧光测定条件：激发和发射单色仪狭缝宽度均为5 nm，扫描速度为1000 nm/min。所用试剂无水乙醇、蒽和芘都为分析纯。

1.1样品配置

分别称取0.05g的分析纯蒽和芘粉末，用适量的无水乙醇溶解，转移至500mL棕色容量瓶中，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀定容，分别配置浓度均为0.1g/L的蒽和芘的储备液，置于阴凉处。移取不同量的蒽和芘储备液，采用逐步稀释法配置浓度均为1×10-5g/L蒽和芘单组份溶液以及浓度为5×10-5g/L蒽和芘的混合溶液。

1.2同步和异步二维荧光相关同步谱的计算

假设原始常规一维荧光光谱A(m×n)包含m个光谱，根据二维相关Noda理论[14]，则同步二维荧光相关谱Φ(ν1,ν2)可表示为：

(1)

异步二维荧光相关异步谱Ψ(ν1,ν2)可表示为：

(2)

式中，T表示转置，N为m阶方阵(m是光谱数)，称为Hilbert-Noda矩阵，其矩阵元为：

2　结果与讨论

根据文献[15]可知，在320nm波长光的激发下，蒽的无水乙醇溶液在379 nm、400 nm和424 nm处存在3个较强荧光峰，其中400nm处荧光峰最强；而芘的无水乙醇溶液在373 nm和393 nm处存在两个较强荧光峰，其中393nm处荧光峰最强。因此，在400nm和393nm荧光峰位置，分别采集了单组份蒽和芘无水乙醇溶液的激发谱(见图1a)。从图中可以看出，蒽在325nm和340nm存在较强的激发峰，其中340nm处最强；而芘在270nm、318nm和334nm存在较强的荧光峰，其中270nm处最强。

本实验的研究目标是通过激发波长外扰的二维相关荧光谱，实现蒽芘混合溶液重叠荧光峰的解析。为了实现上述目标，需要对激发波长进行选择。由于二维相关荧光谱体现的是随外扰变化的特征信息，因此选择激发波长的原则是：①在选定激发波长下，蒽和芘的荧光强度反向变化，且是单调变化(即蒽的乙醇溶液的荧光强度随外扰激发波长的变化单调增加或减小，而芘的乙醇溶液的荧光强度随外扰激发波长的变化单调减小或增加)；②为了提高信噪比，所选定的激发波长中包括蒽和芘的最佳激发波长(最强激发峰多对应的波长)。基于上述原则，实验中，选择了5个激发波长λ1～λ5，分别为270nm、320nm、325nm、330nm和340nm。图1b给出了蒽(400nm)和芘(393nm)的无水乙醇溶液在λ1～λ55个激发长下荧光强度的变化。很显然，随着激发波长的变化，蒽在400nm位置处的荧光强度单调增加，芘在393nm位置处的荧光强度单调减小。

采集λ1～λ55个波长270nm、320nm、325nm、330nm、340nm激发下，蒽芘混合溶液(5×10-5g/L)的常规一维荧光谱(见图2)。显然，在270nm光的激发下，蒽芘混合溶液的荧光峰主要来自芘，仅在424nm处出现弱的蒽荧光峰，这与图1a激发谱所提供的信息一致。随着激发波长的增大，芘的荧光信息逐渐被蒽的荧光峰覆盖，当激发波长为340nm时(蒽的最佳激发波长)，混合溶液的荧光峰主要来自蒽，在400nm和424nm处都出现较强的荧光。

图2　蒽芘混合溶液在λ1，λ2，λ3，λ4和λ5分别激发下的荧光谱

为了实现对蒽芘混合溶液中重叠的荧光峰进行解析和指认，以上述所选择的5个激发波长为外扰，以平均谱为参考谱，在350～450 nm范围内对图2中5个动态光谱依据式(1)和式(2)进行相关计算，得到同步和异步二维荧光相关谱。在相关谱图中，阴影部分是负相关区域，而非阴影部分是正相关区域。

同步二维荧光相关谱是关于主对角线对称的，表征的是所研究体系随激发波长变化的“相似性”信息。随着激发波长的变化，若两个波长λi和λj处的荧光峰强度变化方向相同，则在(λi，λj)处同步交叉峰为正；反之，同步交叉峰为负。由于在5个波长光的激发下，蒽的无水乙醇溶液荧光强度单调增加，而芘的荧光强度单调减小。根据Noda规则：蒽和芘各自荧光的同步交叉峰都为正(用“+”表示)；蒽与芘相互间荧光的同步交叉峰为负(用“-”表示)。因此，可通过同步二维荧光相关谱中交叉峰的正负来对蒽芘混合溶液中重叠的荧光峰进行确认。

图3是浓度为5×10-5g/L蒽芘无水乙醇混合溶液的同步二维荧光相关谱。显然，在主对角线上出现5个较强的自相关峰，其位置分别在369nm、378nm、391nm、400nm和424nm处，说明这5个波长处的荧光峰强度随着外扰激发波长改变而变化。在主对角线外侧存在几个较强的交叉峰，表1给出了各同步交叉峰的正负情况。根据参考文献[15]，并结合图2，可知424nm处蒽的荧光峰并未被覆盖，所以可以根据该峰与其它峰相关的正负来对混合溶液中的重叠峰进行确认。从图3和表1可以看出，在(424，369)nm和(424，391)nm处存在负的交叉峰，表明369nm、391nm与424nm处荧光峰强度随激发波长变化方向相反，因此，369nm和319nm的荧光峰来自混合溶液中的芘。在(391，369)nm处存在正的交叉峰，进一步说明其来源相同。在(424，378)nm、(424，400)nm处存在正的交叉峰，表明378nm、400nm与424nm处荧光强度随激发波长变化方向相同，因此，378nm和400nm的荧光峰来自混合溶液中的蒽。(378，369)nm、(400，369) nm处的负相关峰以及(400，378)nm的正相关峰也都进一步说明了混合溶液中各荧光峰的来源。

图3　激发波长外扰，同步二维相关荧光谱

波长369378391400424369+378-+391+-+400-+-+424-+-++

图4是浓度为5×10-5g/L蒽芘无水乙醇混合溶液的异步二维荧光相关谱。异步二维荧光相关谱是关于主对角线反对称的，没有自相关峰，表征的是研究体系随外扰激发波长变化的“差异性”信息。若两个波长(λi，λj)处存在异步交叉峰，表明λi和λj处荧光峰强度随激发波长变化的快慢不同；若不存在异步交叉峰，则表明λi和λj处荧光峰强度随激发波长变化的快慢相同，不存在差异性，即λi和λj处的荧光峰来源可能相同。表2给出了各异步交叉峰的正负或有无情况。从图4和表2中可以看到，在(424，369)nm和(424，391)nm处出现负的交叉峰，表明369nm、391nm与424nm处荧光峰强度随外扰激发波长变化的速率不同，因此369nm和391nm处的荧光峰来自混合溶液中的芘。在(424，378)nm和(424，400)nm处并没有交叉峰出现，表明378nm、400nm与424nm随外扰激发波长变化的速率相同，因此378nm和400nm处的荧光峰来自混合溶液中的蒽。同时，(391，369)nm和(400，378)nm处不存在异步交叉峰，都进一步证明了上述结论。

图4　激发波长外扰，异步二维相关荧光谱

波长369378391400424369378-391无+400-无-424-无-无

3　结论

研究结果表明，激发波长为外扰的二维荧光相关谱实现蒽芘混合溶液重叠荧光峰的解析是可行的。与常规荧光谱相比，该方法操作简单，而且能提供不同荧光团之间相互作用信息。将二维荧光光谱技术与平行因子等算法结合实现3种或更多组分多环芳烃混合溶液中重叠荧光峰有效解析，还有待于后续研究工作的进一步开展。该研究为检测复杂环境中多组分的多环芳烃污染物提供理论和实验基础。

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Resolution of overlapping PAH peaks based on two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy.

Sun Xueshan,Yang Renjie*，Dong Guimei, Zhou Changhong， Yang Yanrong, Zhang Weiyu

(CollegeofEngineeringandTechnology,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin300384,China)

Two-dimensional (2D) fluorescence correlation spectroscopy was applied to the resolution of highly overlapping fluorescence peaks of anthracene and pyrene in ethanol solution under the perturbation of excitation wavelength. At the same time, the origin of fluorescence bands of anthracene and pyrene were verified in terms of the existence or inexistence of corss peaks in asynchronous spectrum.

two-dimensional fluorescence correlation spectroscopy; anthracene; pyrene; ethanol

天津市自然科学基金(14JCYBJC30400)，天津市教委科技发展基金(20140621)和国家自然科学青年基金(No.31201359)资助

孙雪杉，1992年生，硕士，研究方向：光谱检测技术及其应用，E-mail: 953170743@qq.com。

杨仁杰，1978年生，副教授，研究方向：光谱检测技术及其应用，E-mail: rjyang1978@163.com。

10.3936/j.issn.1001-232x.2016.05.007

2015-11-09