雌激素上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2基因表达中GPR30信号途径的研究

包图雅，白萨日娜，杨燕燕，纳仁高娃

（1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

雌激素上调绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-2基因表达中GPR30信号途径的研究

包图雅1，白萨日娜1，杨燕燕2，纳仁高娃1

（1.内蒙古医科大学基础医学院，内蒙古 呼和浩特 010110；2.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

［目的］探讨 G 蛋白偶联受体 30（G Protein-Coupled Receptor 30，GPR30）在 17β-雌二醇（E2）上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2基因表达过程中的作用。［方法］将GPR30激动剂G1（10-7mol/L）和17β-雌二醇（10-6mol/L）加入到第2代的绵羊输卵管上皮细胞中，培养6、12和24 h，运用实时荧光定量 PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技术测定不同时间点绵羊 β-防御素-2（sheep β-defensin-2，SBD-2）基因的表达量变化。［结果］与对照组相比较，G1和雌激素共同作用6 h后，绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2基因的表达量极显著升高（P＜0.01），同时还具有明显的时间效应。［结论］雌激素上调绵羊输卵管上皮细胞内SBD-2基因表达的膜受体途径是由GPR30介导的。

G蛋白偶联受体30；雌激素；输卵管上皮细胞；β-防御素-2；雌激素膜受体途径

防御素是一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽，并且具有调节体内黏膜免疫的功能。哺乳动物生殖系统内分布着大量防御素，是生殖道黏膜免疫中的重要防御因子，可抵御生殖道的上行感染，对维持正常生殖系统微生物环境的稳态及妊娠的成功均起关键作用。雌性动物体内中一种作用广泛的类固醇类激素雌激素对生殖系统中防御素的表达存在着一定的相关性。有研究表明，生殖道防御素的表达与雌性动物的生理周期有关，并且雌激素是促进生殖道内防御素表达的因素之一［1-3］。雌激素发挥效能的信号途径主要是雌激素核受体介导的。但近年研究发现了雌激素效能发挥的快速非基因组效应，即雌激素膜受体途径，有证据表明［4-7］雌激素膜受体存在并可通过G蛋白偶联受体30（G Protein-Coupled Receptor 30，GPR30）来迅速激活细胞内的第二信号系统［8］，进一步间接调控了一系列的基因转录，并可在多种细胞类型中发挥生物学效应。

GPR30是否是雌激素促进绵羊输卵管上皮细胞β-防御素基因表达的非基因组调控过程中的膜受体未见相关报道。该文探讨了雌激素上调绵羊输卵管上皮细胞内β-防御素-2基因（sheep βdefensin-2，SBD-2）表达中GPR30在雌激素膜受体信号通路中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 绵羊输卵管上皮细胞的培养 待第1代绵羊输卵管上皮细胞汇合至80%～90%后，弃去DMEM/F12（美国GIBICO公司）培养液，经PBS（含双抗）洗1～2次，37℃预热的0.05%胰酶-0.02%EDTA消化5～10 min，加含有20%的胎牛血清（天津澣洋生物公司）培养液来终止消化，在1 000 r/min条件下离心5 min，移液器反复吹打制成单细胞悬液，接种于6孔板中，并放入37℃、5%CO2培养箱中进行细胞培养。

表1 引物

图1 SBD-2测序结果

1.2 细胞干预试验 待第2代绵羊输卵管上皮细胞75%汇合后，换无血清培养液培养24 h，将细胞分为G1（德国Merck公司）组与对照组。将G1（10-7mol/L）加入细胞内培养1 h后再添加17β-雌二醇（10-6mol/L），混匀后分别培养 6、12 和 24 h，每个时间点设相应的对照组，并且在相应的时间点采用极速抽提试剂盒FASTAGEN-RNAfast 200（上海飞捷生物公司），按操作说明提取各组细胞总RNA。

1.3 cDNA的制备 采用PrimeScriptTMRT reagent Kit（大连宝生物工程公司）试剂盒对提取的RNA进行反转录，体系为 10 μL：Prime Script RT Enzyme Mix 0.5 μL，5 ×Prime Script Buffer 2 μL，Oligo dT Primer （50 μmol/L）0.5 μL，Random 6 mers（ 100 μmol/L）0.5 μL，Total RNA6.5 μL。反转录反应条件：反转录反应37℃15 min，反转录酶失活反应85℃5 s。

1.4 qPCR 以反转录 cDNA产物作为模板，用SYBR Premix Ex TaqTMKit（大连宝生物工程公司）进行qPCR反应体系20 μL的扩增:Template cDNA 2 μL，SYBR Premix Ex TaqTM10 μL， 上、 下游引物（见表 1）各 0.4 μL，无菌水 7.2 μL。

PCR的反应条件为：95℃预变性1 min；95℃变性 10 s，63℃退火 20 s，72℃延伸 10 s，82℃读板，共40个循环。扩增后PCR产物送至大连宝生物公司进行基因序列的测定。

1.5 数据分析 实验结果SBD-2 mRNA相对表达量的计算使用2-△Ct公式来计算，其中△Ct=（目的基因 Ct值-β-actin Ct值）［9］。 数据采用平均值±标准误（X±S）进行表示。利用统计学软件SPSS 19中的Least Significant Difference（LSD）程序中的单因子方差分析对实验数据进行统计分析。

2 结果

2.1 目的基因的序列测定 SBD-2 qPCR扩增产物测序结果见图1。测序后经DNAStar软件分析，与绵羊β-防御素-2（SBD-2）的cDNA序列一致，为目的产物。因此，所设计的引物可以用于SBD-2基因表达量的检测。

2.2 qPCR扩增曲线与熔解曲线 SBD-2和βactin的扩增曲线见图2和图3。由图2和图3可知，呈现出标准指数曲线特征，扩增效果良好。SBD-2和β-actin的熔解曲线见图4和图5。由图4和图5可知在Tm值为83.5℃和88.5℃时出现了单一峰，各主峰的Tm值均与扩增产物的理论Tm值相近，并且均无杂峰，表明qPCR产物为SBD-2和β-actin基因的特异性产物。

2.3 G1对E2上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 mRNA表达的影响 如图6所示，G1对E2上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 mRNA表达有明显的时间效应，细胞内添加G1和E2共同处理6 h后，G1组SBD-2 mRNA的表达量就显著增加，与对照组的SBD-2 mRNA的表达量比较差异极显著 （P＜0.01）。细胞内添加G1处理12 h与24 h后，G1组SBD-2 mRNA的表达量高于对照组，但差异不显著（P＞0.05）。随着G1处理细胞时间的延长，G1对细胞内SBD-2 mRNA的表达量影响呈下降趋势。

图2 SBD-2扩增曲线图

图3 β-actin扩增曲线图

图4 SBD-2熔解曲线

图5 β-actin熔解曲线

图6 G1对E2上调绵羊输卵管上皮细胞内SBD-2 mRNA表达量的影响

3 讨论

雌激素作用靶细胞的信号转导途径主要有雌激素核受体途径（即基因组途径）和雌激素膜受体途径即（非基因组途径）。GPR30作为一种膜结合的雌激素受体，在细胞中缺少雌激素受体ERα和ERβ时介导了雌激素对靶细胞的快速效应。有研究表明GPR30作为雌激素膜受体在生殖系统的功能发挥和发育过程中起着十分重要的作用［10］。雌激素对生殖领域中防御素的表达存在着一定的相关性。基于以上背景，该研究探讨了雌激素对绵羊输卵管上皮细胞内SBD-2基因表达的膜受体途径是否由GPR30所介导。

E2上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 mRNA基因表达作用可能是通过由GPR30介导的雌激素膜受体途径和雌激素核受体途径，为了区分开E2上调SBD-2 mRNA基因表达调控中哪一条是主效通路，以及GPR30在E2上调绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 mRNA表达中所起到的作用，选择3个处理时间段 （6、12、24 h）在细胞处理组中添加了GPR30选择性激动剂G1。结果显示，G1和E2共同处理细胞6 h后，G1组SBD-2 mRNA的表达量显著高于对照组SBD-2 mRNA的表达量，差异极显著（P＜0.01），表明 GPR30介导 E2调节绵羊输卵管上皮细胞中的SBD-2 mRNA表达量的作用较迅速，GPR30介导了雌激素对绵羊输卵管上皮细胞SBD-2调节表达信号通路的膜受体途径。而随着孵育时间的延长，G1激活E2上调SBD-2 mRNA表达量作用趋势逐渐减小，在12 h时G1组中SBD-2 mRNA的表达量高于对照组中SBD-2 mRNA表达量，但表达差异不显著（P＞0.05，而在细胞处理24 h后G1组SBD-2 mRNA的表达量与对照组SBD-2 mRNA表达量基本持平。由此表明E2调节绵羊输卵管上皮细胞中SBD-2 mRNA的表达在6 h之前主要是由雌激素膜受体途径介导，而6 h后主要由雌激素核受体介导了E2对SBD-2 mRNA的调节作用。

雌激素可作用于膜受体GPR30，并激活细胞内第二信号系统［4-7］，以上研究结果表明，E2引起绵羊输卵管上皮细胞内第二信号系统SBD-2基因的转录及其表达量的增加，这一效应可能与GPR30介导的非基因效应有关。研究结果为应用GPR30激动剂作用雌激素相关药物调节受感染器官的防御素表达，以及深入研究雌激素或其他调控因子对防御素表达的影响机制提供基础，并且对绵羊生殖道疾病的预防等也具有一定理论价值与意义。

［1］HAN J H,KIM M S,LEE M Y,et al.Modulation of human beta-defensin-2 expression by 17beta-estradiol and progesterone in vaginal epithelial cells ［J］.Cytokine，2010，49（2）：209-214.

［2］包图雅，白萨日娜，曹贵方，等.17β-雌二醇对诱导绵羊输卵管上皮细胞β-防御素-1（SBD-1）基因表达的影响 ［J］.内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版），2014，43（1）：81-85.

［3］包图雅，纳仁高娃，白萨日娜，等.17β-雌二醇对绵羊输卵管上皮细胞 β-防御素-2（SBD-2）表达的影响［J］.畜牧与饲料科学，2015，36（1）：10-13.

［4］SHANG Y,HU X,DiRENZO J,et al.Cofactor dynamics and sufficiency in estrogen receptor-regulated transcription［J］.Cell，2000，103（6）：843-852.

［5］CARMECIC,THOMPSON D A,RING H Z,etal.Identification of a gene（GPR30） with homology to the G-protein-coupled receptor superfamily associated with estrogen receptorexpression in breastcancer ［J］.Genomics,1997,45（3）：607-617.

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Estrogen Up-regulates β-defensin-2(SBD-2)Expression in Ovine Oviduct Epithelial Cells via GPR30 Signaling Pathway

BAO Tuya1，BAI Sarina1，YANG Yan-yan2，Narengaowa1
（1.College of Basic Medical Sciences，Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010110，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Hohhot010031，China）

［Objective］To assess the roles of G protein-coupled receptor 30（GPR30） in the up-regulatory effects of 17βestrodiol （E2） on β-defensin-2（SBD-2） expression in ovine oviduct epithelial cells.［Methods］The 2ndpassage ovine oviduct epithelial cells were treated with GPR30 agonist G1（10-7mol/L）and E2（10-6mol/L）for 6,12,24 h,respectively.Quantitative real-time PCR（qPCR） was used to evaluate the expression of SBD-2 gene in different observation time points.［Results］Compared with control group,the expression of SBD-2 gene in ovine oviduct epithelial cells was significantly up-regulated（P＜0.01） at the 6thhour of co-treatment of G1 and E2,expressing an obvious time effect.［Conclusion］The GPR30 mediates the membrane receptor signaling pathway involved in SBD-2 gene expression up-regulation in ovine oviduct epithelial cells induced by estrogen.

GPR30；estrogen；oviduct epithelial cells；SBD-2；estrogen membrane receptor signaling pathway

S826；Q579.13

A文章顺序编号：1672-5190（2016）10-0004-04

2016-09-15

项目来源：内蒙古自然科学基金项目（2014BS0801）；内蒙古医科大学校级教学改革研究项目（NYJXG 2016072）。

包图雅（1978—），女，副教授，博士，主要从事组织胚胎学与分子生物学研究工作。

纳仁高娃（1977—），女，副教授，博士，主要从事疼痛医学与蒙药学研究工作。

（责任编辑：钱英红）