一株增香微生物的分离鉴定及其发酵产香条件优化

余　翔，李元实，刘　栋，王瑞停，帖金鑫，马　林，*

(1. 郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002； 2. 吉林烟草工业有限责任公司 生产技术中心，吉林 延吉 133000； 3. 广东中烟工业有限责任公司 技术中心，广东 广州 510385)



一株增香微生物的分离鉴定及其发酵产香条件优化

余翔1，李元实2，刘栋3，王瑞停2，帖金鑫1，马林1，*

(1. 郑州轻工业学院 食品与生物工程学院，河南 郑州 450002； 2. 吉林烟草工业有限责任公司 生产技术中心，吉林 延吉 133000； 3. 广东中烟工业有限责任公司 技术中心，广东 广州 510385)

从14种烟叶表面筛选出一株能够利用烟末发酵产香的菌株GXY35，通过生理生化实验和16S rDNA序列对其进行分析，并用GC/MS对发酵液的香气成分进行分析。结果表明：GXY35分离株属于克雷伯氏杆菌，发酵液中特征香味物质4-乙烯基愈创木酚的含量最高。在单因素试验的基础上通过正交试验，对菌株的发酵条件进行优化。结果表明，最适宜的产香发酵条件为：料液比1∶20，接种量12%，发酵温度37 ℃，发酵时间72 h，pH值7.0。在此条件下，特征香味物质4-乙烯基愈创木酚的含量最高可达0.725 mg·mL-1。

生物香料；特征香味物质；发酵产香；卷烟香气

近年来，国内外越来越多的烟草研究者对烟草香味物质进行研究，已经取得了很大的进展，但主要集中在以化学或者物理方法处理烟叶方面。此外，国内外也有一些关于利用微生物发酵或者酶促反应来改善烟叶总体质量的研究报道[1-9]，但多集中在烟叶感官质量和常规化学成分的变化上，对利用烟草废料或废弃烟末发酵增香的应用研究少有报道。赵铭钦等[10]研究了不同生物制剂处理对发酵烤烟烟叶中香气物质含量的影响，结果表明：处理后的发酵烟叶中大多数香气成分，如大马酮、二氢大马酮、紫罗兰酮等，含量有一定的增加趋势。通过利用烤烟叶面上存在着的微生物对烟叶进行发酵增香，可以定向增加烟叶的香气，充分保持烟叶的原有品质。朱大恒等[11]提出了一种新型生产烟草香料的方法，直接利用产香微生物发酵烟叶制备生物香料。周瑾等[12]从优质烤烟叶上分离筛选得到一种优势的微生物菌种，并将其接种于低等级烤烟烟叶的碎片上，测定发酵前后烟叶碎片化学成分的变化，结果发现，发酵后的低等级烟叶中，有机酸含量有一定程度的增加，还原糖含量明显降低。研究表明：将发酵后的烟草废料中提取到的香味物质，运用到卷烟加香评吸中，能够明显降低卷烟刺激性，增加卷烟香气，掩盖烟草杂气，一定程度上可改善卷烟的吸食品质[13]。在烤后烟叶表面上存在着大量的微生物，本文拟从烤后烟叶表面筛选出能够利用废弃烟末发酵产香的微生物，对其进行分离鉴定，并优化增香微生物发酵产香的条件，旨在利用烟叶微生物发酵废弃烟末加工生产出带有烟草天然香韵的生物香料。

1　材料与方法

1.1材料与设备

发酵烟末为河南中烟工业有限责任公司废弃烟叶；牛肉膏、蛋白胨、琼脂等生化试剂，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钙、硫酸亚铁、氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸镁等试剂，均为分析纯，购自天津大茂化学试剂厂。

SW-CJ-2D净化工作台，苏州净化设备有限公司；LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LR56495型高速冷冻离心机，美国Thermo Fisher科技公司；HZQ-F160型全温振荡培养箱，太仓市实验设备厂；Veriti 96-Well Thermal Cycler型PCR仪，美国Applied Systems公司；MiniBIS Pro凝胶成像仪，以色列DNR成像系统有限公司；Leica DM750光学显微镜，德国徕卡微系统有限公司；T6新世纪型紫外可见分光光度计，北京普析仪器有限公司；感量0.000 1 g分析天平，北京赛多利斯天平有限公司；HP6890/5976型GC/MS气质联用仪，美国惠普公司。

1.2试验方法

1.2.1培养基配制

基础培养基：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 mg·L-1，NaCl 5 g·L-1，琼脂粉20 g·L-1，pH值为7.2～7.4，0.1 MPa置于高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃灭菌30 min。

筛选培养基：阿魏酸0.75 g，KH2PO40.9 g，Na2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCl20.1 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，无菌水定容至1 000 mL，置于高压蒸汽灭菌锅中，121 ℃下灭菌30 min。

发酵培养基：按料液比1∶10在筛选培养基基础上添加发酵烟末。

1.2.2菌株的分离纯化

称取5 g烟叶于250 mL锥形瓶中，加入100 mL无菌水。37 ℃，200 r·min-1振荡培养15～30 min。将菌液依次稀释成10-1～10-7的浓度梯度，均匀涂布于含有基础培养基的平板上，放入37 ℃恒温培养箱中培养24 h，观察平板菌株的生长情况，选择最适浓度梯度。挑取出不同形态的单菌落，采用平板划线法分离纯化菌株，并编号保存。

1.2.3菌株的筛选

挑取一环纯菌株，接入筛选培养基试管中，将试管置于恒温振荡培养箱中，37 ℃，150 r·min-1振荡培养24～48 h。取出后，在通风条件较好的环境下，观察记录分离菌株发酵液的外观和香气特征变化情况。

1.2.4菌株的鉴定

产香菌株的生理生化特性按照常规方法进行分析鉴定[14]。

另采用Ezup柱式基因组DNA抽提试剂盒提取菌株总DNA，送交上海生物工程公司测序。PCR扩增使用通用引物，以27F作为上游引物，1492R作为下游引物。

1.2.5发酵液香味成分的分析及发酵条件优化

将产香菌接入不含琼脂的基础培养基中，37 ℃，150 r·min-1振荡培养24 h。再按一定比例，将种子液接入发酵培养基培养72 h。用二氯甲烷萃取发酵液，收集有机相于三角瓶中，添加一定量无水硫酸钠，4 ℃静置过夜。加入1 mL乙酸苯乙酯作为定量分析的内标物质，经浓缩处理，得到1 mL淡黄色挥发性物质，进行GC/MS定性定量分析，确定其特征香味物质。通过3次重复单因素试验探究料液比、发酵温度、发酵时间、起始pH值以及微生物接种量对发酵液产香效果的影响，并用SPSS 19.0 软件对各因素进行方差分析，同时通过正交试验对其最佳发酵条件进行优化[15-16]。

2　结果与分析

2.1菌株的筛选分离及鉴定

从不同原材料中共分离出71株菌，其中18株对筛选培养基有产香效果，将其分别接入发酵培养基后，最终选出1株有明显增香效果的菌种，编号为GXY35，发酵增香菌的生理生化鉴定结果见表1。PCR产物经连接、转化，筛选阳性克隆和测序，得到长度为1 058 bp的序列，提交到GenBank，采用BLAST程序与已知序列进行相似性分析。结果发现，发酵增香菌GXY35与Klebsiellasp. SHN-1，Klebsiellasp. SFR-111，Klebsiellavariicolastrain XF13等克雷伯氏杆菌属(Klebsiellasp.)的菌株同源性均为99%，且其生理生化鉴定结果也与之符合，故将GXY35鉴定为克雷伯氏杆菌属(Klebsiellasp.)。

2.2发酵液特征香味成分分析

准确量取50 mL发酵液于圆底烧瓶中，再向其中加入300 mL蒸馏水和30 g NaCl，以60 mL二氯甲烷作为萃取剂，在60 ℃水浴中进行同时蒸馏萃取，结果如图1。萃取150 min后，分离有机相，加入1 mL乙酸苯乙酯作为定量分析的内标物质，在60 ℃水浴中减压浓缩，除去大部分有机溶剂，得到淡黄色挥发性物质。所得挥发性组分进行GC/MS分析。

表1菌株GXY35生理生化反应鉴定结果

Table 1Identification result of strain GXY35 by physiological and biochemical test

测试项目测试结果测试项目测试结果革兰氏染色-V-P-鞭毛染色-淀粉水解-芽孢染色-硝酸盐-伴孢晶体-吲哚-荚膜染色+石蕊牛奶+柠檬酸盐+甲基红M-R+葡萄糖产酸-明胶液化-

注：-为阴性； +为阳性。

采用同时蒸馏萃取方法，得到一个峰面积相对于其他成分较高的香味物质，通过质谱分析后，确定该香味物质成分为4-乙烯基愈创木酚(图2)，并以4-乙烯基愈创木酚作为该产香菌株的特征发酵产香物质。

图1　同时蒸馏萃取发酵液气质色谱图Fig.1　Temperament chromatogram of fermentation broth by SED

2.3菌株产香发酵条件优化

2.3.1发酵温度对香味物质含量的影响

从图3可以看出，温度对微生物的生长及特征香味物质含量有显著影响。发酵温度过高或过低都不利于微生物的生长，在37 ℃时，香味物质累积量最大，说明微生物代谢能力在此时较强。

2.3.2起始pH值对香味物质含量的影响

在37 ℃下，测定菌株发酵产香的最适初始pH。由图4可看出，当起始pH值为7.0时，特征香味物质的积累量达到最大。

2.3.3微生物接种量对香味成分的影响

由图5可以看出，随着微生物接种量的增加，发酵液香味物质含量也随之增大。当接种量从8%提高到12%时，香味物质成分的含量显著增加，但增幅不及之前。考虑到工业生产中的成本问题，因此选择8%作为最适微生物接种量。

2.3.4料液比对香味成分的影响

控制料液比分别为1∶20，1∶12，1∶10和1∶8，向发酵液中添加烟末，在初始pH值7.0，微生物接种量8%，发酵温度37 ℃条件下，发酵72 h，研究不同料液比对香味成分含量的影响，结果如图6所示。随着料液比的增大，菌株产香效果先稳步增加；但当料液比增大到1∶8时，特征香味物质含量显著下降。这可能是由于较高的料液比下，不利于微生物与溶氧的充分接触，降低了其代谢强度。综合考虑，选择1∶10为微生物发酵的最适料液比。

图2　4-乙烯基愈创木酚与标准谱库的对比Fig.2　Comparison between 4-vinylgualacol and the standard library of spectra

不同处理间无相同小写字母的表示差异显著(P<0.05)，下同。图3　发酵温度对香味成分含量的影响Fig.3　Effect of fermentation temperature on content of aroma components

图4　起始pH值对香味成分含量的影响Fig.4　Effect of pH on content of aroma components

2.3.5发酵时间对香味成分的影响

按1∶10的料液比向发酵液中添加烟末，在初始pH值7.0，微生物接种量8%，发酵温度37 ℃条件下，分别发酵24，48，72，96 h，研究不同发酵时间对香味成分的影响情况。由图7可知，随着发酵时间延长，特征香味物质含量增加；但当发酵时间从72 h延长至96 h，香味物质含量增幅较小；且较长的发酵时间可能会造成发酵液中烟碱累积量增加，故选择72 h为最适发酵时间。

图5　微生物接种量对香味成分含量的影响Fig.5　Effect of inoculums size on content of aroma components

图6　料液比对香味成分含量的影响Fig.6　Effect of solid-liquid ratio on content of aroma components

图7　发酵时间对香味成分的影响Fig.7　Effect of fermentation time on content of aromacomponents

2.4产香发酵条件优化

根据单因素试验结果，选取发酵温度、起始pH值、接种量、发酵时间和料液比5个因素进行正交试验，具体水平设置见表2。

正交试验结果见表3。由表3可知，极差由大到小依次是A>D>B>C>E，表明各因素对香味物质含量的影响依次为温度>发酵时间>起始pH>接种量>料液比，最佳组合为A3B3C4D3E1，即料液比1∶20，接种量12%，发酵温度37 ℃，发酵时间72 h，起始pH值7.0。在此条件下，特征香味物质的含量最高，通过内标物质计算其准确含量，可达0.725 mg·mL-1。对正交试验结果做方差分析，结果显示，各因素中只有温度对特征香味物质含量的影响达到显著水平。

表2正交试验因素水平表

Table 2Factors and levels in orthogonal array design

水平A:温度/℃B:起始pHC:接种量/%D:发酵时间/hE:料液比水平1285.01241∶20水平2326.04481∶12水平3377.08721∶10水平4439.012961∶8

表3正交试验结果

Table 3Results of orthogonal array design

试验号ABCDE含量/(mg·mL-1)1111110.5202122220.5273133330.5524144440.3515212340.5376221430.3647234120.3478243210.3139313420.41110334310.72511331240.38112342130.53813414230.17114423140.10115432410.14116441320.112K10.4870.4090.3440.3760.424K20.3900.3550.3990.3480.349K30.5130.4290.3440.4810.406K40.1310.3290.4360.3170.343R0.3820.1000.0920.1640.081

3　讨论

烟叶经过适当的发酵处理后，青杂气明显减弱，香气突出较好，而油润和光泽基本保持，烟叶品质有较明显的改善，其烟叶等级也有相应的提升[17-18]。烟叶在发酵后，其叶片表面上仍然生存着一些优势种群的微生物，即使在温度高达70 ℃的条件下进行发酵，仍然会有一些微生物残存于烟叶表面。本研究从陈化的烟叶表面筛选出一株发酵产香菌株GXY35，该菌株能够利用废弃烟末发酵生产制备烟草生物香料。通过常规形态学、生理生化反应以及16S rRNA序列分析对菌株进行鉴定，结果表明，GXY35分离菌株属于克雷伯氏杆菌属(Klebsiellasp.)。在研究料液比、接种量、发酵温度、发酵时间和起始pH各单因素影响的基础上，采用正交试验，得出菌株GXY35产香的最佳发酵条件为：料液比1∶20，接种量12%，发酵温度37 ℃，发酵时间72 h，起始pH值7.0。通过GC/MS图谱分析可知，发酵液中主要的挥发性香味成分有：4-乙烯基愈创木酚、异戊酸、棕榈酸、5-羟甲基糠醛、糠醇、2，3-二氢苯并呋喃、2-乙酰基吡咯等，相对含量以4-乙烯基愈创木酚的最高。在最佳发酵条件下，菌株产香的特征香味物质4-乙烯基愈创木酚的含量可以达到0.725 mg·mL-1。目前，国内少有利用废弃烟末发酵制取烟用香料的研究报道，明红梅等[19]利用芽孢杆菌发酵产香制备香曲，其产香物质每100 g样品中仅含有1.710 mg愈创木酚，与其相比，GXY35菌株具有更高效的产香能力。利用GXY35菌株对废弃烟末进行发酵制备生物香料，能够产生4-乙烯基愈创木酚的特征香味物质成分，可以定向增加卷烟的香气，还可为开发带有烟草天然香韵的生物香料及在卷烟加工过程中增加香气提供科学依据，且有望实现烟渣废弃物的高附加值、无害化和资源化利用，降低卷烟生产资源的浪费，为烟草加工和烟草农业的绿色清洁生产提供技术支持。

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(责任编辑高峻)

Isolation and identification of an aroma-producing strain and optimization of its fermentation condition

YU Xiang1， LI Yuan-shi2， LIU Dong3, WANG Rui-ting2， TIE Jin-xin1, MA Lin1，*

(1.SchoolofFoodandBioengineering，ZhengzhouUniversityofLightIndustry，Zhengzhou450002，China; 2.ProductionandTechnicalCenter，JilinTobaccoIndustryCo.，Ltd.，Yanji133000，China; 3.TechniqueCenter,ChinaTobaccoGuangdongIndustrialCo.,Ltd,Guangzhou510385,China)

An aroma-producing strain GXY35 was isolated from 14 kinds of tobacco leaves， and the aroma components were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS). The strain was identified asKlebsiellasp. from physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA. The content of 4-vinylgualacol in fermentation broth was the highest. On the basis of single factor test， the fermentation condition of strain was optimized by orthogonal experiment. The optimal fermentation condition was as follows: the solid-liquid ratio of 1∶20， the inoculums size of 12%， the fermentation temperature of 37 ℃， the fermentation time of 72 h， and the initial pH of 7.0. Under the optimal fermentation condition， the content of the characteristic favoring substance of 4-vinylgualacol was 0.725 mg·mL-1.

bioflavours; characteristic flavoring substances; aroma-producing fermentation; flavor compounds in cigarette

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.04.20

2015-08-07

余翔(1991—)，男，河南信阳人，硕士研究生，研究方向为烟草生物技术。E-mail: yuxiang7455718@163.com

，马林，E-mail: malindf@vip.sina.com

TS49

A

1004-1524(2016)04-0670-06

余翔，李元实，刘栋，等. 一株增香微生物的分离鉴定及其发酵产香条件优化[J]. 浙江农业学报，2016，28(4)： 670-675.