胰腺炎大鼠腹腔引流术诱发肺组织内NF-κB和TNF-α的表达变化及丙泊酚的干预效应

徐文会, 杨 敏

(1山西医科大学第二医院麻醉科，太原 030001; 2山西省儿童医院麻醉科)



胰腺炎大鼠腹腔引流术诱发肺组织内NF-κB和TNF-α的表达变化及丙泊酚的干预效应

徐文会, 杨 敏

(1山西医科大学第二医院麻醉科，太原 030001;2山西省儿童医院麻醉科)

目的 探讨胰腺炎大鼠腹腔引流术诱发肺组织内NF-κB和TNF-α的表达变化及丙泊酚的干预效应研究。 方法 80只SD雄性大鼠随机分为假手术组(sham组)，胰腺炎组(SAP组)；胰腺炎+腹腔引流组(引流组)，胰腺炎+腹腔引流+丙泊酚干预组(丙泊酚组)，每组20只。术后12 h观察各组肺组织病理情况，检测血浆以及肺组织中NF-κB和TNF-α情况。 结果 sham组0 h、12 h肺组织病理评分低于其他各组(P<0.05)。引流组、丙泊酚组12 h时的病理评分低于SAP组(P<0.05)。引流组、丙泊酚组12 h时血清及肺组织中的NF-κB和TNF-α均低于SAP组(P<0.05)。丙泊酚组12 h时血清及肺组织中的NF-κB和TNF-α均低于引流组(P<0.05)。引流组和丙泊酚组的血清及肺组织中的NF-κB和TNF-α均低于SAP组(P<0.05)。 结论 丙泊酚干预能够降低胰腺炎大鼠肺组织内NF-κB和TNF-α的表达水平，提高腹腔镜引流治疗胰腺炎效果，其作用机制可能与其减少了炎症因子释放有关。

胰腺炎； 腹腔引流； NF-κB； TNF-α； 丙泊酚

重症胰腺炎是临床上常见的危急重症，病情严重且瞬息多变，病程进展快，死亡率高，预后差。肺损伤是重症胰腺炎常见的并发症之一，发生率高达60%-70%，是导致患者死亡的重要原因。腹腔引流是临床上治疗重症胰腺炎的重要方法，可以引流出大量炎性因子、毒素以及活化酶等，以减轻全身炎症反应。丙泊酚是常用的麻醉药物，具有起效迅速、作用时间短、副作用少等优点。近来有动物实验显示，丙泊酚能够减轻重症胰腺炎大鼠的肺组织损伤[1]。本研究旨在分析胰腺炎大鼠腹腔引流术诱发肺组织内NF-kB和TNF-a的表达变化及丙泊酚的干预效应，以期为临床治疗提供理论与依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

80只SD雄性大鼠，清洁级，体重(250±20)g， 山西医科大学实验动物中心提供，昼夜明暗交替时间：12 h/12 h。饲料喂养，饮水为自来水瓶装后高压灭菌。动物自由采食和饮水；每周换两次经高压灭菌的松木刨花垫料。饲养室内每周用0.5%新洁尔灭水溶液喷雾消毒一次。将以上大鼠饲养1周后随机分为4组，每组20只。分别为假手术组(sham组)，胰腺炎组(SAP组)；胰腺炎+腹腔引流组(引流组)，胰腺炎丙泊酚干预组(丙泊酚组)，将每组中的大鼠按手术后标本采集时间分为0 h、12 h两个亚组，每组10只大鼠。

1.2 方法

1.2.1 胰腺炎模型的制备 制模前实验动物禁食12 h，自由饮水，用10%的水合氯醛(剂量为0.5 ml/kg)腹腔内注射麻醉，麻醉平稳后，采用传统的Aho等[2]介绍的方法建立大鼠急性胰腺炎模型，肉眼见胰腺组织充血、水肿、出血、坏死等改变后，表明制备急性胰腺炎模型成功。而对照组麻醉后不进行胰腺炎模型制备。

1.2.2 胰腺炎腹腔引流及丙泊酚干预 胰腺炎模型制备成功后，引流组在大鼠右侧下腹部置入引流管，分层关腹后在引流管尾端接上引流袋。SAP组大鼠仅造模不进行干预。丙泊酚组大鼠在制作模型前30 min经股静脉采用丙泊酚干预，静脉注射丙泊酚10 mg/(kg·h)持续输注，然后在大鼠右侧下腹部行引流术。

1.3 标本取材和处理

1.3.1 取材 各组大鼠于处理后第0,12小时于大鼠的下腔静脉采血2 ml注入EFTA抗凝管中，用于血浆炎性因子NF-κB和TNF-α的检测。12 h取血后处死大鼠，取左肺上叶，称质量后放入80 ℃温箱烘烤48 h，烘干后再次进行称重，计算肺湿干质量比，在以上标本中取组织块，分割成3块，每块约为0.6 cm×0.6 cm，一块用于HE染色，一块用于免疫组化试验，一块保存待用。

1.3.2 HE染色和免疫组化实验 将所获取病理组织经4%甲醛固定48 h后(pH=7.4)，将组织修块，采用石蜡包埋，标本经4 μm连续切片，室温放置30 min后，切片常规二甲苯脱蜡，梯度酒精水化，消除内源性过氧化物酶的活性。一部分用于HE染色，进行组织形态学观察，行肺脏病理学评分。一部分用于免疫组化染色，用于观察NF-κB和TNF-α蛋白的表达情况。免疫组化封片后随机选择60个具有代表意义的高倍视野(×40)，以平均光度单位为指标， 每个视野中计数 100 个细胞的阳性表达细胞数，判断表达程度。所用试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.3.3 血浆NF-κB和TNF-α浓度的检测 将所取血液标本离心后取上清，放置于4 ℃冰箱保存，统一检测。采用ELISA 法测定各组血清炎症因子NF-κB和TNF-α的浓度，操作严格按照试剂盒说明进行，波长450 nm。

1.3.4 免疫组化的结果判定 无色为0分；染色弱(浅棕黄色)但明显强于阴性对照为1分；染色清晰(棕黄色)为2分；染色强(棕褐色)为3分。阳性细胞率≤25%为1分，阳性细胞率26%-50%为2分，51%-75%为3分，>75%为4分。将以上两项得分相加，0分判为阴性(-)，1-2分判为弱阳性(+)，3-4分判为中度阳性(++)，5-6分为强阳性(+++)[3]。

1.3.5 肺组织病理学评分方法 每张切片随机选10个高倍镜视野。分为水肿、炎细胞浸润和出血三级组织病变。以 0-10分的组织病理学评分来确定肺部的炎症反应程度 ,评分包括支气管周围浸润部位的百分比、支气管周围浸润的数量、支气管管腔内的渗出、血管周围的浸润、实质性肺炎五方面。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织损伤情况

sham组假手术后12 h，肺组织出现轻微的肺泡壁水肿，但无炎细胞浸润，无出血发生。SAP组造模后12 h大面积肺实变，肺泡腔消失。引流组造模后12 h的病理改变较SAP组轻，出现肺泡壁水肿、增厚，部分肺泡腔闭塞。丙泊酚组有少量肺泡壁水肿，少量炎性细胞浸润，无肺泡腔闭塞(见图1)。SAP组、引流组、丙泊酚组0 h、12 h的病理评分高于sham组，差异有统计学意义(P<0.05)。引流组、丙泊酚组12 h时的病理评分低于SAP组(P<0.05)。丙泊酚组在12 h的肺组织病理评分低于引流组(P>0.05，见表1)。

2.2 各组大鼠血清中NF-κB和TNF-α的比较

SAP组、引流组、丙泊酚组0 h、12 h的NF-κB和TNF-α水平高于sham组(P<0.05)。引流组、丙泊酚组12 h时血清的NF-κB和TNF-α低于SAP组(P<0.05)。丙泊酚组的NF-κB和TNF-α水平低于引流组(P<0.05，见表2)。

图1 各组大鼠肺组织病理损伤情况 (HE,×400)Figure 1 Pathological changes of lung tissues in rats (HE,×400)

表1 各组大鼠肺组织病理评分比较

Table 1 Comparison of pathological score of lung tissues

组别n0h12hsham组100.55±0.120.53±0.18SAP组101.88±0.51△6.65±1.34△引流组101.45±0.43△4.05±1.67△#丙泊酚组101.05±0.11△#*3.12±1.04△#*

与sham组相比，△P<0.05；与SAP组相比，#P<0.05；与引流组相比，*P<0.05

2.3 各组大鼠肺组织中NF-κB和TNF-α的表达情况结果比较

SAP组、引流组、丙泊酚组大鼠肺组织中的NF-κB和TNF-α的表达均高于sham组(P<0.05)。引流组、丙泊酚组的肺组织中的NF-κB和TNF-α的表达均低于SAP组(P<0.05)。丙泊酚组NF-κB和TNF-α低于引流组(P<0.05，见表3)。

表2 各组大鼠血清中的NF-κB和TNF-α的比较

Table 2 Comparison of Nf-κB and TNF-α levels in serum of rats

组别NF-κB(ng/L)TNF-α(ng/L)0h12h0h12h sham组28.11±3.8730.12±4.5856.12±11.8573.28±12.38 SAP组78.12±7.56△101.53±7.59△127.21±21.37△171.54±23.45△ 引流组70.52±11.45△57.12±10.43△#110.34±17.57△90.21±10.34△# 丙泊酚组52.12±10.36△#*50.27±11.25△#*87.26±10.25△#*82.31±11.37△#*

与sham组相比，△P<0.05；与SAP组相比，#P<0.05；与引流组相比，*P<0.05

表3 各组大鼠肺组织中NF-κB和TNF-α的表达情况比较(%)

Table 3 Comparison of the expression of NF-κB and TNF-α in lung tissues of rats(%)

与sham组相比，△P<0.05；与SAP组相比，#P<0.05；与引流组相比，*P<0.05

3 讨论

急性胰腺炎是临床上常见的危重疾病，病程进展迅速，可出现多种并发症，其因导致胰酶异常激活引起的胰腺甚至全身性炎性反应性疾病可引起机体多器官功能衰竭，病死率较高。急性肺损伤是胰腺炎胰外脏器损伤中最常见的表现，也是导致患者死亡的最主要因素。就目前而言，胰腺炎导致肺损伤的机制尚未完全清楚，可能与中性粒细胞在肺内的聚集、活化、释放等因素有关[4]。近年来虽然不断有新的方法用于急性胰腺炎肺损伤的治疗，但并未彻底改变肺损伤致死性的局面。

核转录因子κB(NF-κB)是广泛存在于各种细胞胞质内的核转录因子，而且含量很高。NF-κB具有调节基因转录的功能，参与许多基因的表达。当细胞受到外界刺激时，NF-κB的抑制物将迅速磷酸化导致NF-κB激活，NF-κB激活可增加IL-6和TNF-α的表达，参与机体防御反应，如炎症、细胞凋亡、感染、肿瘤发生等，导致肺损伤[5]。有研究显示，NF-κB高水平激活是引起重症胰腺炎合并肺损伤的重要原因[6]。TNF-α是最重要的炎症细胞因子，可促进T细胞产生各种炎症因子，进而促进炎症反应的发生，调节机体炎症及免疫应答。TNF-α可直接作用于肺，增加内皮细胞的通透性，引起肺水肿，还能通过促进中性粒细胞释放大量介质损伤肺组织。已经有研究表明，TNF-α在肺损伤的发病机制中发挥重要作用，其表达水平在一定程度上表示肺损伤的严重程度[7]。本研究结果显示，胰腺炎大鼠中的血浆、肺组织的NF-κB、TNF-α均高于假手术组，而且随着时间的推移有上升的趋势，说明以上两组因子参与了胰腺炎的肺组织损伤过程，在肺损伤发生、发展过程中起着重要作用，与以往的研究基本一致[8]。

腹腔引流可引流出胰腺炎患者腹水中大量的炎症因子及各种有毒物质，减少以上物质对胰腺炎病情发展的作用。有研究显示，腹腔镜引流可将腹水中的NF-κB引流出体外，减少炎症物质吸收入血，对胰腺炎大鼠起到保护作用[9]。丙泊酚是一种常用的麻醉药，其除了麻醉作用外，据相关研究报道[10]还能抑制自由基的生成，发挥抗炎、抗氧化作用。有研究显示，丙泊酚能够降低大鼠肿组织NF-κB、TNF-α的表达，对肺损伤有保护作用[11]。本研究结果显示，经腹腔引流和腹腔引流联合丙泊酚干预后胰腺炎大鼠血清中和肺组织中的NF-κB、TNF-α均低于胰腺炎大鼠组。说明两种方法均能够降低NF-κB、TNF-α的表达，发挥肺保护作用。但两种方法联合干预的效果好于腹腔镜引流单独干预，说明丙泊酚的应用增强了腹腔引流的效果，在一定程度上预防了胰腺炎大鼠肺损伤的发生。综上所述，丙泊酚能够降低胰腺炎大鼠肺组织内NF-κB和TNF-α的表达水平，提高腹腔镜引流治疗胰腺炎的治疗效果，其作用机制可能与其减少了炎症因子释放有关。

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Changes of expression of NF-κB and TNF-α in lung tissues of rats with acute pancreatitis and the effect of propofol

XU Wenhui1, YANG Min2

(1DepartmentofAnesthesiology,SecondHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China;2Children’sHospitalofShanxiProvince)

ObjectiveTo investigate the expression of NF-κB and TNF-α in lung tissues of rats with acute pancreatitis and the effect of propofol on the changes.MethodsEighty SD male rats were randomly divided into sham group, severe acute pancreatitis group(SAP group), SAP+abdominal drainage group(drainage group), SAP+abdominal drainage+propofol group(propofol group)(n=20 in each group). Pathological changes of lung tissues were observed at 12 h after surgery, and the expression of NF-κB and TNF-α in plasma and lung tissues was detected.ResultsThe pathological scores at 0 h and 12 h were higher in SAP group, drainage group and propofol group than that in sham group(P<0.05). The pathological score in drainage group and propofol group was lower than in SAP group at 12 h(P<0.05). In drainage group and propofol group, the NF-κB and TNF-α levels in serum were lower than those in SAP group(P<0.05). In propofol group, the NF-κB and TNF-α levels in serum were lower than those in drainage group(P<0.05). The TNF-α and NF-κB levels in serum and lung tissues in drainage group and propofol group were lower than that in SAP group(P<0.05).ConclusionPropofol can improve the laparoscopic drainage effect in the treatment of pancreatitis and reduce the expression of NF-kB and TNF-a in lung tissues of rats with acute pancreatitis, which may be related to the decrease of release of inflammatory factors.

pancreatitis; abdominal drainage; NF-κB; TNF-α; propofol

国家自然科学基金资助项目(81400260)

徐文会，男，1976-11生，硕士，主治医师，E-mail：superred001@163.com

2016-06-10

R

A

1007-6611(2016)09-0818-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2016.09.008