荜拔酰胺通过调控PI3K/Akt信号通路促进胃癌BGC-823细胞p53表达的实验研究*

温桂海　王涛　朱涛

(1.邯郸市中心医院普外一科，河北 邯郸 056001; 2.四川大学华西医院，四川 成都 610041)



荜拔酰胺通过调控PI3K/Akt信号通路促进胃癌BGC-823细胞p53表达的实验研究*

温桂海1王涛1朱涛2

(1.邯郸市中心医院普外一科，河北 邯郸 056001; 2.四川大学华西医院，四川 成都 610041)

目的研究荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的抑制作用和对p53表达的调节作用及相关的分子机制。方法采用不同浓度的荜拔酰胺(0μM、2μM和20μM)对胃癌BGC-823细胞进行干预。在不同时间点(0h、24h和48h)采用MTT法对BGC-823细胞活性进行检测。干预48h后，采用qPCR对荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53 mRNA表达水平进行检测。采用western blot对荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53蛋白表达水平以及PI3K和Akt活化水平进行检测。结果采用不同浓度荜拔酰胺(0μM、2μM和20μM)对胃癌BGC-823细胞进行干预后，细胞活性呈时间依赖性和浓度依赖性下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。荜拔酰胺干预48h后，胃癌BGC-823细胞p53 mRNA和蛋白的表达水平呈浓度依赖性增加而PI3K和Akt活化水平呈浓度依赖性降低，差异均存在统计学意义(P<0.05)。结论研究结果表明，荜拔酰胺可以通过下调PI3K/Akt信号通路的活化水平对胃癌BGC-823细胞的增殖产生显著抑制作用，并发现该机制与促进抑癌基因p53的表达密切相关。

荜拔酰胺； 胃癌； BGC-823细胞； p53； PI3K； Akt

【Objective】To explore the anti-cancer property of piperlongumine (PL) in gastric cancer BGC-823 cells and its underlying molecular mechanism. MethodsThree specific concentrations (0μM, 2μM and 20μM) of PL were included in current study. At different time points (0h, 24h and 48h), the cell viabilities of gastric cancer BGC-823 cells were calculated by MTT assay. Meanwhile, the mRNA expression of p53 was measured by qPCR. Then, Western blot was performed to analyze the protein expression of p53 and the phosphorylation of PI3K and Akt. ResultsGastric cancer BGC-823 cells viabilities were dosage-dependently and time-dependently inhibited by PL. Meanwhile, after 48 hours of administrations, our data figured out that p53 expression was dosage-dependently up-regulated and the phosphorylation of PI3K and Akt were dosage-dependently reduced by PL in gastric cancer BGC-823 cells. ConclusionThe anti-tumor property of piperlongumine (PL) very likely results from up-regulation of p53 through the inactivation of PI3K/Akt signal pathway in gastric cancer BGC-823 cells, provides the promising of the clinic use of piperlongumine in the treatment of gastric cancer and other malignant tumors in future.

流行病学调查显示，近年来胃癌(gastric cancer)的发病率虽有所降低，但其仍然是人类最常见的恶性肿瘤之一，目前仍位居全球恶性肿瘤发病率的第4位和肿瘤死亡人数的第2位[1-4]。国际癌症研究机构(international agency for research on cancer, IARC) 2008年的调查发现胃癌的发病有明显的地域性，其中东亚地区的韩国(62.2/10万人)、蒙古共和国(48.2/10万人)、日本(46.8/10万人)和中国(41.3/10万人)是胃癌发病率最高的区域[1-4]。临床研究显示胃癌的病理类型以腺癌(adenocarcinomas)更为常见[1-4]。荜拔酰胺(piperlongumine, PL)是胡椒科植物荜茇(Piper longum Linn.)、长柄胡椒(P. sylvaticum Roxb)和瘤突胡椒(P. tuberculatum Jacq.)等的有效药理成分，其主要在植物的根部含量较高[5-7]。目前多个研究发现荜拔酰胺具有抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞增殖和分化等多种药理作用[5-7]。同时在对非小细胞肺癌和白血病细胞的研究中证实荜拔酰胺的抗肿瘤活性与调控PI3K/Akt信号通路密切相关[8, 9]。本文研究荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的抑制作用和对p53表达的调节作用及相关的分子机制。

1　材料和方法

1.1主要试剂和材料PCR试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；MTT试剂盒购买于美国Promega公司；鼠抗人p53抗体、鼠抗人phospho-PI3K抗体、鼠抗人PI3K抗体、鼠抗人phospho-Akt抗体、鼠抗人Akt抗体和鼠抗人β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；小牛血清购买于美国Bovogen公司；荜拔酰胺购买于美国Sigma公司；RPMI-1640培养基购买于美国Gibco公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养胃癌BGC-823细胞常规接种在含10% FBS、100g/L 青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、95%空气、5% CO2孵箱内培养。每48 h换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2细胞活性检测取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96孔培养板中，每孔接种100 μL约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞16h至24h，使细胞同步化。加入不同浓度(0μM、2μM和20μM)的荜拔酰胺，在37℃，5% CO2条件下培养细胞，未干预组作为对照组。使用MTT比色试验对不同时间点(0h、24h和48h)的细胞生长状态进行测定，实验重复4次。对应时间点的细胞活性(%) = (OD干预组/OD对照组) ×100 (%)[10]。

1.2.3细胞GLUT1 mRNA表达检测按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，反转录为cDNA，以cDNA为模板进行qPCR反应。p53正义 5′- GAGGGATG TTTGGGA GATGTAA-3′，反义5′- CCCTGGTTA GTACGG TGAAGTG-3′；β-actin正义：5′-TGGCA TTGCCG ACAG GAT-3′，反义：5′-GCTCAGGAGG AGCAATGATCT-3′。使用β-actin作为内参基因，使用2-△△CT公式计算目的基因相对表达量。ΔΔCt = (Ct,目标-Ct,β-actin)干预组-(Ct,目标-Ct,β-actin)对照组[11]。

1.2.4Western blot法检测细胞p53蛋白表达水平以及PI3K和Akt磷酸化水平按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1h，分别加入鼠抗人p53抗体、鼠抗人phospho-PI3K抗体、鼠抗人PI3K抗体、鼠抗人phospho-Akt抗体、鼠抗人Akt抗体和鼠抗人β-actin抗体，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描[12]。

1.3统计学分析采用SPSS 21.0进行单因素方差分析，计量资料以均数±标准差表示。两样本均数多重比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1MTT法结果分析在不同浓度(0μM、2μM和20μM)荜拔酰胺(PL)干预后，采用MTT法对不同时间点(0h、24h和48h)胃癌BGC-823细胞活性进行检测。与对照组细胞相比较，荜拔酰胺干预的胃癌BGC-823细胞活性呈浓度依赖性和时间依赖性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

Figure 1Cell viabilities of gastric cancer BGC-823 cells at different time points

药物浓度不同时间点0h24h48h0μM100%100%100%2μM99.07±4.1371.88±13.06①51.29±7.16①20μM101.11±3.8942.32±9.24①②30.05±4.52①②

注：对应时间点与0μM相比较①P<0.05，对应时间点与2μM相比较②P<0.05。

2.2p53 mRNA和蛋白的表达给予胃癌BGC-823细胞不同浓度(0μM、2μM和20μM)荜拔酰胺(PL)干预48h后，采用qPCR和western blot法对BGC-823细胞p53 mRNA和蛋白的表达进行检测。与对照组细胞相比较，给予荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖性增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2和图1。

Table 2The mRNA and protein expression levels of p53 and the phosphorylation of PI3K and Akt in gastric cancer BGC-823 cells

药物浓度p53mRNAp53蛋白PI3K磷酸化水平Akt磷酸化水平0μM10.25±0.050.96±0.020.98±0.032μM7.22±2.13① 0.48±0.15①0.61±0.21① 0.56±0.18①20μM18.89±6.17①②0.94±0.09①②0.37±0.04①②0.41±0.09①②

注：与0μM相比较①P<0.05，②与2μM相比较P<0.05

图1胃癌BGC-823细胞p53蛋白表达的western blot结果

Figure 1Western blot result of the protein expression of p53 in gastric cancer BGC-823 cells

2.3PI3K磷酸化水平给予胃癌BGC-823细胞不同浓度(0μM、2μM和20μM)荜拔酰胺(PL)干预48h后，采用western blot法对BGC-823细胞PI3K磷酸化水平(phospho-PI3K/PI3K)进行检测。与对照组细胞相比较，荜拔酰胺干预的BGC-823细胞PI3K磷酸化水平呈剂量依赖性下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图2和表2。

图2胃癌BGC-823细胞PI3K磷酸化的western blot结果

Figure 2Western blot result of the phosphorylation of PI3K in gastric cancer BGC-823 cells

2.4Akt磷酸化水平给予胃癌BGC-823细胞不同浓度(0μM、2μM和20μM)荜拔酰胺(PL)干预48h后，采用western blot法对BGC-823细胞Akt磷酸化水平(phospho-Akt/Akt)进行检测。与对照组细胞相比较，荜拔酰胺干预的BGC-823细胞PI3K磷酸化水平呈剂量依赖性下降，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图3和表2。

图3胃癌BGC-823细胞Akt磷酸化的western blot结果

Figure 3Western blot result of the phosphorylation of Akt in gastric cancer BGC-823 cells

3　讨论

胃癌(gastric cancer)作为消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在我国具有高发病率、高致死率和低治愈率的特征[1～4]。临床和基础研究均证实幽门螺旋杆菌感染(Helicobacter pylori infection)是最为重要的胃癌发生的危险因素[2,13-14]。研究认为有幽门螺旋杆菌感染与65%～80%的胃癌(即全球约660000例)发生密切相关[2,13-14]。同时研究还发现使用抗菌素有效治疗幽门螺旋杆菌感染可以显著降低胃癌的发病率[2,13-14]。进一步研究显示幽门螺旋杆菌感染可以诱导胃组织浅层的炎症反应和上皮细胞表型的改变[2,13-14]。同时流行病学调查揭示吸烟、种族、饮食习惯和经济状况以及地理环境等均与胃癌的发生有相关性[2,13-14]。由于胃癌较高的发病率和较低的生存率(大部分5年生存率均在20%左右)，寻求新的治疗方式和方法将具有重要的价值和意义[2,13-14]。

中草药荜茇主要用于腹泻、呕吐和消化不良的临床治疗。荜拔酰胺(piperlongumine, PL)是中药胡椒科植物荜茇(Piper longum Linn.)、长柄胡椒(P. sylvaticum Roxb)和瘤突胡椒(P. tuberculatum Jacq.)等的有效药理成分[5-9]。近期的研究表明荜拔酰胺具有抑制血小板凝集、抗细菌和真菌以及蠕虫、镇痛、抑制炎症反应、抑制肿瘤细胞增殖、分化、浸润和转移等多种生物学活性[15-18]。Sun LD等的研究发现荜拔酰胺及其衍生物对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞表达的NO、PGE2、iNOS以及COX-2等炎症分子均有显著的抑制作用[15]。同时Son DJ等的研究发现荜拔酰胺对于小鼠冠状动脉粥样硬化斑块的形成有显著的抑制作用[16]。Jin HO等的研究显示荜拔酰胺可以有效的抑制乳腺癌细胞的增殖[17]。Liu QR等的实验揭示荜拔酰胺对胶质母细胞瘤LN229细胞和U87MG细胞的增殖和侵袭有显著的抑制作用[18]。在本研究中我们的数据显示与对照组未干预细胞相比较，荜拔酰胺干预的胃癌BGC-823细胞活性呈浓度依赖性和时间依赖性降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。该结果表明荜拔酰胺对胃癌BGC-823细胞的增殖有显著的抑制作用。

目前大量的研究证实PI3K/Akt信号通路的过度活化在包括非小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、胃癌和肝癌等恶性肿瘤细胞的增殖、分化、浸润以及血管生成过程均扮演着重要的角色[19-21]。Bonelli MA等的研究显示PI3K抑制剂NVP-BKM120和NVP-BYL719均可有效的抑制肺鳞状细胞癌细胞上皮-间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)过程及肿瘤细胞体外和体内增殖过程[19]。Ying J等对胃癌患者病理组织分析后发现PI3K和磷酸化AKT的表达水平与患者肿瘤的神经和血管浸润、肿瘤的大小以及淋巴结转移及其他组织器官转移等与肿瘤分期和恶性程度相关的指标间具有正相关性[20]。Tian F等的实验也证实防己诺林碱可以通过下调PI3K/Akt信号通路的活化水平有效抑制胃癌SGC7901细胞的增殖过程[21]。另一方面近期的研究显示荜拔酰胺的生物活性与下调PI3K/Akt信号通路的活化密切相关[8-9]。Wang F等通过在体和离体实验显示荜拔酰胺对于非小细胞肺癌A549细胞的抑制作用与下调PI3K/Akt信号通路的活化密切相关[8]。在本实验中我们发现与对照组未干预细胞相比较，荜拔酰胺干预的胃癌BGC-823细胞PI3K和Akt磷酸化水平呈剂量依赖性下降，差异均有统计学意义(P均<0.05)。该结果表明荜拔酰胺可以有效下调胃癌BGC-823细胞PI3K/Akt信号通路的活化。

此外由于PI3K/Akt信号通路对于重要抑癌基因p53的表达具有关键调控作用[22-23]。本实验中我们对p53的表达进行检测后发现与对照组未干预细胞相比较，给予荜拔酰胺干预的BGC-823细胞p53 mRNA和蛋白表达水平呈浓度依赖性增加，差异均有统计学意义(P均<0.05)。该结果表明荜拔酰胺对于胃癌BGC-823细胞p53的合成有促进作用。

4　结论

本研究表明，荜拔酰胺可以通过下调PI3K/Akt信号通路对胃癌BGC-823细胞的增殖产生显著抑制作用，并发现该机制与促进抑癌基因p53的表达密切相关。

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Piperlongumine promotes p53 expression via inactivation of PI3K/Akt signal pathway in gastric cancer BGC-823 cells

WEN Guihai1, WANG Tao1, ZHU Tao2

(1.DepartmentofTheFirstGeneralSurgery,HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China; 2.WestChinaHospital,SichuanUniversity,Chengdu610000,China)

Piperlongumine; Gastric cancer; BGC-823 cells; p53; PI3K; Akt

中国博士后科研基金(2014M552369)

R 735.2

Adoi：10.3969/j.issn.1672-3511.2016.10.003

2015-10-08； 编辑： 陈舟贵)