嗜盐单胞菌ST-1的分离及其石油烃类降解特性的研究

秦春艳

（中国航天建设集团有限公司 北京 100071）

嗜盐单胞菌ST-1的分离及其石油烃类降解特性的研究

秦春艳

（中国航天建设集团有限公司 北京 100071）

从油田石油污染物中分离出了一株菌株ST-1，通过形态和16S rDNA序列的分析，初步鉴定属于Halomonas的一个种。对该菌株降解石油烃的能力进行了实验，结果表明，菌株生长的指数期石油烃降解速率较大， 最大降解率达到80%以上， 降解的最适温度为27～34℃，最适 pH 为 6.8～8.3。提高接种量可以加快反应速度。

嗜盐单胞菌 石油烃 降解特性

广泛存在于土壤、地下水、海洋、湖泊等环境中的天然微生物种群对石油烃的降解作用是石油污染物从环境中消除的基本途径之一［1,2］。

本文从大庆油田石油污染土壤中分离筛选到一株菌株ST-1,通过形态和16S rDNA序列分析对菌株进行了鉴定,并对其石油烃降解的特性进行了研究,以期为该菌株在石油污染物的降解中的应用提供科学依据。

1 实验部分

1.1 培养基

富集培养基（g/L）：KH2PO43.48,Na2HPO41.5,MgSO40. 70,（NH4）2SO44,酵母粉0.01,2%乙醇,0.5%柴油,PH=7.0～7.2。用于石油烃降解菌的富集培养。

配制牛肉膏蛋白胨培养基,用于菌株的形态观察、保存及活化。

1.2 石油烃降解菌的分离和筛选

取无菌水（含有玻璃珠）90ml,将其中加入土样10g或水样10ml。取富集培养基95ml,将其中加入上清液5ml,于25℃,200r/min的摇床富集培养3d。取新鲜的富集培养液80ml,将其中转接入培养液20ml,继续培养,一共转接4次。

取富集培养液,按梯度稀释后,涂平板,在25℃条件下培养3d,随机挑取菌落,采用划线的方法反复分离纯化,直至得到纯培养菌株。

1.3 菌株的鉴定

1.3.1 形态观察

准备牛肉膏蛋白胨平板,将分离得到的菌株涂布于上,在25℃条件下,培养2d,观察长出的菌落形态、做革兰氏染色反应和观察细胞在电子显微镜下的形态。

1.3.2 16S rDNA的PCR扩增及序列测定

将划线分离后的菌株,挑取单菌落,进行16S rDNA的PCR扩增,用0.1%的琼脂糖凝胶对其PCR产物进行电泳,经过goldview染色后,在紫外下照射观察PCR产物条带情况,产物交测序公司测序［3］。

1.4 菌株的石油降解特性分析

准备牛肉膏蛋白胨的液体培养基,将活化后的菌株接种到其中,在25℃,200r/min的条件下,摇床富集培养12h,将其作为种子液。以5%的接种量（种子液）接入培养基中,25℃,200r/min的条件下培养,3h取一次样,检测培养基的OD600、PH和石油烃的浓度。

表2-1 菌株ST-1的生理生化测定Table2-1 Physiological and biochemical tests of the strain ST-1

图2-3 菌株 ST-1的系统发育树Fig.2-3 Phylogenetic tree of the strain ST-1

图2-4 菌株不同生长阶段的石油烃降解效果Fig.2-4 Effects of different growth stages of petroleum hydrocarbon degradation strains

为了考察温度、PH值、接种量对石油烃降解的影响,进行了单因素实验：

（1） 温度：将种子液接种到培养基中,在15、20、25、30、35、40℃中培养,每隔24h,测其吸光度。

（2）PH值：将种子液接种到培养基中,用H2SO4或NaOH调节PH,在PH为3,4,5,6,7,8,9,的条件下培养,每隔24h,测其吸光度。

（3）接种量对石油烃降解的影响：分别取2ml、4ml、6ml、8ml接种于石油烃浓度为1000mg/L的培养基中,在25℃,200r/min下培养,每隔8h取样测石油烃的浓度。

图2-5 温度对石油烃降解效果的影响Fig.2-5 The influence of temperature on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

图2-6 PH对石油烃降解效果的影响Fig.2-6 The influence of PH on the effect of petroleum hydrocarbon degradation

图2-7 不同生物量条件下石油烃类的降解率Fig.2-7 The degradation of petroleum hydrocarbons under the conditions of different biomass ratio

2 结果与讨论

2.1 形态特征

菌株在固体培养基上培养后得出结果为该菌的细胞为球状,菌落呈圆形、黄色,表面光滑,不透明,边缘整齐。

2.2 菌株的形态及生理生化测试

对该菌株进行常规生理生化特征鉴定,结果见表2-1。

2.3 系统发育树的构建

将菌株的16S rDNA碱基的全序列输入GenBank核酸序列数据库,发现与假单胞菌属10个菌株的同源性在 93%～94%,将与菌株ST-1同源性最高的菌株序列构建系统发育树。由图 2-3可见,这些同源性序列分为4个不同的分支,菌株 ST-1与Halomonas 位同于一个分支,并且这个分支的支持率达到90%,而其它的3个属可以作为外群,菌株 ST-1定位于Halomonas属,, 所以从这个聚类关系可以判断, 菌株 ST-1属于Halomonas的一个种。

2.4 菌株的石油烃降解特性

2.4.1 不同生长阶段的石油烃降解特性

菌株在不同生长曲线下的石油烃降解曲线如图2-4所示。

菌株4h后进入指数期,24h后进入稳定期。石油烃降解主要发生在指数期,24h时石油烃降解率达到81.3%,期间的最大石油烃降解速率达6.25mg/（Lh）；其后培养液中的石油烃浓度变化不大。菌株ST-1的延滞期短,生长速度快,这可能是其石油烃降解速率较高的主要原因之一［4,5］。

2.4.2 石油烃降解效果受环境因子的影响

前面所测的温度和PH对菌株ST-1的石油烃降解效果的影响见图2-5和2-6。在不同温度下,菌株ST-1培养至12h时,其石油烃降解效果差异显著,由于菌株的生长速度快,从而使石油烃降解作用也较快,本实验测得30℃时去除效率是最高的,故此温度下石油烃被降解的最多。在27～34℃内,石油烃降解速率均在80%以上,其中,在15～40℃时,石油烃都有不同程度的降解,表明菌株降解石油烃的温度适应范围较广。

菌株ST-1的PH适应范围较广,在PH为6.8～8.3时,石油烃降解速率均达90%以上,但PH＜6时,石油烃降解效果急剧降低,这可能与菌株较能适应碱性环境的特性相关［6］。

2.4.3 菌株对石油烃降解效果的影响

本实验从菌株的接种量对石油烃的降解效果来研究,从图2-7可以看出,提高接种量可以加快反应速度,缩短延迟期,但接种量在6.0～8.0ml之间时,接种量对石油烃的降解速率影响不大,并且生物量越高,石油烃降解率迅速上升期也较短。

3 结论

（1）本实验得到的菌株 ST-1在固体培养基上的生长特征、形态特征以及温度适应性、pH值范围等。通过 16S rDNA等分子生物学手段的鉴定可以初步判断此菌种属于Halomonas属,且有可能为新种。

（2）本实验对菌株ST-1对石油烃的降解进行了研究, 结果表明,石油烃降解发生在菌株生长的指数期,最大降解率达到80%以上, 降解的最适温度为27～34℃,最适 pH为6.8～8.3,此时,最大降解速率达到90%以上。

（3）本实验从菌株的接种量对石油烃的降解效果方面进行了研究,结果表明,提高接种量可以加快反应速度,缩短延迟期,但接种量达到一定值时,对石油烃的降解速率影响不大,并且生物量越高,石油烃降解率迅速上升期也较短。

［1］姚德明，许华夏.石油污染土壤生物修复过程中微生物生态研究［J］.生态学杂志，2002，21（1）：26～28.

［2］A tlas R.M.and Pramer D.Focus on Bioremediation［J］.ASM News，1990，56：7.

［3］Luo Peng， Hu Chaoqun， Zhang luping， et al. Effects of DNA extraction and universal primers on 16S rRNA gene-based DGGE analysis of a bacterial community from fish farming water［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology.2007， 25：310-316.

［4］Plotnikova EG， Alyntseva OV， Kosheleva IA， et al. Bacterial degraders of polycyclic aromatic hydrocarbons isolated from salt-contaminated soils and bottom sediments in salt mining areas. Microbiology. 2001，70：51-58.

［5］邓波等.生化法处理高温高盐油田采出水.中国给水排水，2003，194：76-78.

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1674-2060（2016）03-0315-02

秦春艳（1986—），女，硕士研究生，主要从事环境微生物的研究。