绿色荧光蛋白的原核表达纯化用于基因工程大实验的设计

张会勇 蔡亚丽 张青苗 张孟丹 胡啸 井长勤

（新乡医学院生命科学技术学院 河南新乡 453003）

绿色荧光蛋白的原核表达纯化用于基因工程大实验的设计

张会勇 蔡亚丽 张青苗 张孟丹 胡啸 井长勤

（新乡医学院生命科学技术学院 河南新乡 453003）

目的 通过设计基因工程实验为一综合性探究实验，使学生全面掌握并提升基因工程相关实验技能。方法 借助于绿色荧光蛋白的原核表达及纯化实验，使学生掌握了基因的克隆与表达、以及蛋白纯化等综合实验性技术方法。结果 将以前支离破碎的一个个单个实验环环相扣成为一个整体，最终学生可获得一个肉眼可见的基因工程产物即绿色荧光蛋白。结论 通过基因工程实验的改革提高了学生的学习兴趣，得到了良好的学习效果。

基因工程实验 绿色荧光蛋白 原核表达

如今分子生物学已成为生命科学的通用语言,因此诞生于分子生物学的基因工程实验技术也被列为生命科学相关专业的主干课程［1-2］,所以掌握基因工程相关技术已成为生命科学相关专业人才的必备技能［3］。新乡医学院生命科学技术学院为生物技术及生物工程专业已开设基因工程实验10年左右,基本内容包括电泳技术［琼脂糖凝胶与聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）］,聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术、质粒提取、感受态制备、质粒转化及蛋白印迹（western blotting）等技术。虽然开设内容也达到了培养生物技术及工程相关人才的基本要求,但相关实验内容连贯不强,加上分子水平操作的枯燥及目标产物不可见性,导致学生虽然实验之初兴趣颇高,实验最后却不能有效将相关实验衔接,最终导致最终兴趣缺乏,达不到设想的教学效果。所以有必要对相关课程实验进行改革、重置为综合性实验,用一个实验内容将上述技术串联起来。

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）首先在1962年由Shimomura等首先从多管水母中分离［4］,已证实可在大肠杆菌中表达出活性的GFP［5-6］,日光下菌体呈绿色［5］,且其表达纯化步骤较为简单［6］。所以作者设计GFP的原核表达及纯化为一个综合性实验,通过将GFP基因克隆、酶切、连接、转化以及筛选、表达及纯化等,使学生通过综合性实验获得了一个基因工程的可见产物,极大提高了学生的实验兴趣及成就感。现将实验的详细方案报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

Pfu酶、PCR产物液体回收试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶Nco I、BamH I与DNA连接酶购自宝生物工程（大连）有限公司；BspH I酶购自美国NEB公司；引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成；BL-21,pcDNA3.1-GFP由本实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 GFP原核表达重组子的构建 引物设计：因为GFP序列（GenBank： AB594822.1）中含有Nco I序列,在设计上游引物时用了Nco I的同尾酶BspH I,然后用Oligo6软件设计了它的表达引物并预测了其退火温度。引物序列如下：GFP上游引物：5-GCGTCATGA（BspHI）CTAGCAAAGGAGAAGA-3；GFP 下游引物：5-GCGCGGATCC（BamHI）TCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCA-3。首先以引物GFP 上游引物与GFP 下游引物组合,以真核生物表达载体pcDNA3.1-GFP为模板, PCR扩增GFP的开放阅读框即 （open reading frame,ORF）,扩增条件如下：94℃预变性5 min后,94℃1 min,51℃1 min,72℃1 min, 30个循环,72℃终延伸10 min,反应体系为100 μL,液体回收纯化PCR产物洗脱至50μL,并进行定量,浓度约0.15 g·L-1。然后分别用20U的BamHI和BspHI限制性内切酶对2μg回收PCR产物进行酶切、纯化,对PET28a（1.5mL菌液经质粒提取试剂盒（小量）进行提取,最后用50μL洗脱液洗脱可获得约1μg质粒）用BamH I与Nco I进行双酶切、然后液体回收酶切产物；计算酶切载体与回收片段的摩尔比。按照载体片段1：10（0.3：0.03pmol）的比例进行T4 DNA连接酶16℃连接1 h,连接产物转化BL21感受态细菌,涂布于表面涂有为20%（W/V）的乳糖（Luria-Bertani,LB）固体培养基（50 mg·L-1卡那霉素）37℃培养过夜；挑取变绿的阳性克隆, 扩大培养。

图1 GFP PCR产物的扩增

图2 阳性克隆的筛选

1.2.2 GFP蛋白的表达与纯化 将筛选平板上变绿的阳性克隆接种于5mL试管中（含50 mg·L-1卡那霉素）,培养过夜,然后转接于250mL LB培养基1L摇瓶中,200 r·min-1培养5 h后,加入浓度为20%的乳糖至终浓度为2%,继续培养6～8 h,至肉眼可见菌体变绿,6 000r·min-1×5 min收集菌体。GFP的纯化参阅文献［6］；提纯GFP蛋白用SDS-PAGE鉴定蛋白纯度。

图3 GFP蛋白SDS-PAGE电泳图

2 结果

2.1 PCR结果结果见图1。由图1可以看出,PCR扩增产物分子量为750 bp附近,与预期相符,条带单一可以进行下一步酶切实验。

1：marker；2：GFPPCR扩增产物。

2.2 阳性克隆的筛选 结果见图2。由图2可见,LB平板上绿色克隆均为阳性克隆,因乳糖诱导GFP表达而使阳性克隆在平板上变为绿色。

2.3 GFP蛋白的纯化结果 结果见图3。由图3可以看出,诱导菌体蛋白（泳道2）相对于未诱导对照菌体蛋白（泳道1）,已成功诱导出目的蛋白,且诱导菌体蛋白经硫酸铵沉淀及萃取等步骤后,可获得电泳级的纯化GFP（泳道4）。

1：蛋白分子量标准；；2：BL21-pET28a菌株表达的蛋白； 3：BL21-pET28a-GFP 菌株诱导表达蛋白； 4：GFP纯化蛋白。

3 讨论

本文首先规范化了GFP的原核表达实验及纯化步骤,使之成为一个学生可操作的实验。

由GFP原核表达的综合性实验步骤我们可以看出,通过实验操作使学生掌握了载体的构建、转化、筛选、表达与蛋白纯化等技术,不但使学生掌握了基因工程核心要素“目的基因克隆、酶切、连接、转化及筛选”等上游过程,同时也使学生熟悉了蛋白纯化部分基因工程下游技术。在此过程中同学们也学会了质粒提取、DNA琼脂糖凝胶电泳与SDS-PAGE蛋白电泳技术以及蛋白表达和纯化等实验技术。将以前支离破碎的一个个单个实验环环相扣成为一个整体。

另外,GFP是从水母中首先克隆出来的基因,能够通过原核表达获得其活性产物,使学生更直观的认识到了基因工程可以跨越物种障碍,感受到基因工程的魅力。

GFP表达产物在日光下为肉眼可见的绿色,我们在筛选的卡那霉素抗性LB平板上涂了20%的半乳糖溶液,可直接通过绿色荧光蛋白的表达使阳性克隆变成绿色（图2）,阳性与非阳性克隆一眼就能识别,并且肉眼可见的阳性克隆不存在假阳性问题,无需再用PCR及测序进行再次验证。

第三,GFP蛋白的纯化步骤相对简单,仅需用硫酸铵及乙醇沉淀与萃取步骤即可得到电泳级的蛋白（图3）,可使学生了解蛋白的纯化一些基本技术。

本文通过设计GFP蛋白的原核表达及纯化实验为基因工程综合实验,改革了以前通过一个个单一实验使学生逐项掌握单个技术为目的,变为使学生通过一个综合大实验,将逐个单一技术通过一个综合实验串联起来,成为一个有机整体。通过此次实验,学生可获得一个肉眼可见的基因工程产物即绿色荧光蛋白,所以此次基因工程实验的改革提高了学生的学习兴趣,得到了良好的学习效果。

［1］邢万金，扈延茂.本科基因工程大实验教学改革的实践和体会［J］.生物学通报，2007，42（2）：48-50.

［2］陈鲁勇，孟和，许文平，等.分子生物学实验教学改革与实践［J］. 实验室研究与探索，2008，27（12）：121-122.

［3］王文锋，范雪晖，穆灵敏，等.生物技术专业基因工程实验教学的改进与实践［J］.新乡医学院学报，2009，01：99-100.

［4］Shimomura，O.，F.H.Johnson，and Y.Saiga.Extraction， purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea［J］.J Cell Comp Physiol，1962，59：223～239.

［5］张会勇，鲁勇，孟雨菡，等.VEGF183（132-158）肽段作为蛋白缓释药物载体的细胞外基质结合研究［J］.药物生物技术，2010，03：198-202.

［6］Yakh nin AV，Vin ok urov LM， Su rin AK，et al . Green fluorescent protein purification by organic extraction ［J］.Protein Expr Purif，1998，14：382-386.

Q-4

A

1674-2060（2016）03-0001-02

2014年度河南省高等教育教学改革省级重点研究项目（编号：2014SJGLX050）

张会勇（1976—），男，汉族，博士，副教授，主要从事肽类药物及肿瘤疫苗研究。