猪源可溶性波形蛋白的提取纯化

陈　卓，夏　昶，艾　思，余　兰，方　成,

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学 医学技术与护理学院，湖北 武汉430023)



猪源可溶性波形蛋白的提取纯化

陈卓1，夏昶2，艾思2，余兰1，方成1,2

(1.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；2.武汉轻工大学 医学技术与护理学院，湖北 武汉430023)

建立从猪眼晶状体中提取和一次过柱分离纯化波形蛋白(Vim)的工艺方法。以精提液溶解猪眼晶状体粗提粉，使用单因素实验及响应面分析对精提温度、时间、料液比、pH值四个因素进行优化，利用DEAE Sepharose FF阴离子交换柱分离纯化目标蛋白，以免疫印迹法鉴定波形蛋白，10% SDS-PAGE检测纯化Vim的纯度和相对回收率。精提的最佳工艺条件为：温度13.16 ℃，时间26.01 min，料液比1∶34(g∶mL)，pH7.03。使用DEAE Sepharose FF柱以不少于40倍柱体积的36 mmol/L NaH2PO4缓冲液洗脱后，以100倍柱体积的36—86 mmol/L NaH2PO4缓冲液一次线性洗脱分离Vim。经10%SDS-PAGE结合Image Lab 4.0分析软件检测纯化制得的冻干粉中Vim蛋白纯度达(80.66±1.30)%，相对回收率为(36.56±0.96)%。

猪；波形蛋白；提取；纯化

1　引言

波形蛋白(Vimentin，Vim)为高度保守的真核细胞骨架Ⅲ型中间丝蛋白，主要表达于中胚层起源的间充质细胞中，以多聚体纤维稳定存在。Vim仅溶于离子型表面活性剂如尿素、盐酸胍等溶液，单体分子量为53 kDa，等电点5.05，在pH值7.2—7.4最稳定[1]。Vim具有调节细胞迁移、粘附、信号传导、自身抗原[2]和细胞因子特性[3]，在感染[4]、肿瘤[5]、自身免疫[6]、固有免疫[7]等方面显现多种功能，具有生物药品开发的广阔前景。

Geisler等[8]依次用SephadexG-25、CM-32及DE 52层析柱从猪晶状体提纯Vim。Nelson等[9]使用艾氏腹水肿瘤细胞，以DNA-纤维素层析法得到Vim。Bioemendal等[10]依次用SephadexG-25和PBE94聚焦层析法从牛晶状体纯化Vim。Chou等[11]先用SephadexG-25柱，再用羟基磷灰石柱以8—35 mM磷酸钠线性洗脱分离牛晶状体中的Vim。以上方法因程序复杂而致成本高昂。2012年国内戴丽娟等[12]从人宫颈癌细胞中克隆Vim基因并构建带有GST 标签的PGEX-4T-1-VIM 重组表达质粒，以DH5α菌、BL21菌进行质粒扩增和诱导表达Vim，但未涉及纯化方法。

笔者研究以猪眼晶状体为原料，在单因素提取试验的基础上应用响应面法优化提取Vim的条件，并且创建用DEAE Sepharose FF阴离子交换柱一次层析分离纯化Vim的方法及参数，以提高Vim提纯的效率。

2　材料与方法

2.1仪器

AKTA Prime Plus快速低压液相色谱系统，GE公司；GR21GⅢ高速冷冻离心机，Hitachi公司；SIM FD5-3真空冻干机，Gold-SIM公司；ChemiDoc XRS+凝胶成像系统，Bio-Rad公司；Anke LXJ-IIB水平离心机，上海安亭公司；酶标仪，Tecan sunrise公司。

2.2材料

新鲜猪眼，武汉双汇公司；Vim抗体，圣克鲁斯公司；HRP-羊抗鼠二抗，武汉博士德公司；预染Marker，Thermo公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒，上海碧云天公司；DEAE Sepharose FF预装柱(1mL柱载样量50 mg)，上海博格隆公司；SDS-PAGE凝胶试剂盒，北京鼎国昌盛公司。

2.3方法

2.3.1粗提

取猪眼晶状体置于等体积粗提液(100 mmol/L NaCl、1mmol/L EDTA、10 mmol/L NaH2PO4、pH 6.8、4 ℃)中匀浆，然后10 000×g冷冻离心30 min。取沉淀以10倍体积粗提液复悬，振荡30 min，离心弃上清。重复3次，取沉淀物冻干制得粗提粉，-80 ℃保存。

2.3.2单因素精提实验

以含尿素缓冲液Buffer A (10 mmol/L NaH2PO4、8mol/L尿素、0.5 mmol/L PMSF、1mg/LLeupeptin、1mg/L Aprotinin、1mmol/L DTT，0.22 μm滤膜过滤，超声脱气10 min)为提取液，分别按不同提取温度5 ℃，10 ℃，15 ℃，20 ℃，25 ℃，不同提取时间5 min，17.5 min，30 min，42.5 min，55 min，不同料液比1∶10,1∶20,1∶30,1∶40,1∶50 (g∶mL)以及不同pH值6.0,6.5,7.0,7.5,8.0对40mg粗提粉进行精提[13]。10 000×g冷冻离心30 min，取上清，检测蛋白浓度。

2.3.3响应面分析(RSM)

使用Design-Expert 8.0.6软件的中心组合设计(CCD)，对上述4个单因素进行优化组合[14-15]。使用30 mg粗提粉，检测精提上清液中蛋白含量(mg)作为响应值，在4个因素的5个水平上分析最优的精提参数。

2.3.4分离

液相色谱系统进样口A和B分别置于Buffer A和Buffer B(210 mmol/L NaH2PO4，余同Buffer A)中。将超滤浓缩后的精提物溶液注入预平衡DEAE Sepharose FF柱的上样环内。以Buffer A平衡后，待基线平稳，将洗脱液NaH2PO4浓度设为36 mmol/L，1 mL/min，洗脱40 mL，5mL/管收集。设置NaH2PO4浓度为36—86 mmol/L的线性洗脱，1 mL/min，洗脱100 mL，2 mL/管收集。

2.3.5纯化

以10% SDS-PAGE分析各收集管馏分中蛋白成分，以免疫印迹法(Western- Blot, WB)作Vim蛋白鉴定。合并Vim电泳纯的馏分装入透析袋(8-14 MWCO)，置于透析液(10 mmol/L NaH2PO4、0.5 mmol/L DTT)中充分透析后，冻干得纯化Vim蛋白粉。

2.3.6纯度及相对回收率检测

用PBS溶解Vim冻干粉，将纯化Vim溶液(上样量5 μg，3个平行组)和对应精提物溶液(上样量20 μg)以10%SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色。凝胶成像后用Image Lab 4.0软件作灰度值分析Vim蛋白的纯度。相对回收率 = (纯化蛋白质量×纯化蛋白Vim纯度)/(精提蛋白质量×精提蛋白Vim纯度)。

3　结果与分析

3.1温度对提取液总蛋白含量的影响

改变提取温度，料液比1∶30，pH7.0，提取时间20 min。由图1可见总蛋白含量在5 ℃时最高，此时的总蛋白含量为(25.46±0.15)mg。之后随着温度的升高，蛋白的含量呈下降趋势，虽然最后有小幅上升但含量仍较低。

图1　不同温度对提取液总蛋白溶出度的影响

3.2时间对提取液总蛋白含量的影响

改变提取时间，提取温度为5℃，其他条件不变。如图2从5min起随着提取时间的增加，总蛋白含量也在增加；且在提取时间30 min时达到最高，此时的总蛋白含量为(26.36±0.04)mg。之后随着提取时间的延长蛋白含量呈下降趋势。

图2　不同时间对提取液总蛋白溶出度的影响

3.3料液比对提取液总蛋白含量的影响

改变提取料液比，提取时间30 min，温度5 ℃，其他条件不变。由图3可见总蛋白含量在料液比1∶30(g∶mL)时为(24.08±0.07)mg；之后随着料液比的增加，总蛋白含量略有下降。

图3　不同料液比对提取液总蛋白溶出度的影响

3.4pH值对提取液总蛋白含量的影响

改变提取液pH值，提取温度为5 ℃，料液比1∶30，提取时间30 min。结果如图4，随着pH值的上升总蛋白含量增加，且在pH值为7.0达到最高，此时的总蛋白含量为(26.03±0.07)mg；之后随着pH值的继续升高蛋白的含量呈下降趋势。

图4　不同pH值对提取液总蛋白溶出度的影响

3.5响应面分析

中心组合设计(CCD)及响应面分析检测结果如表1所示，方差分析如表2所示。表2显示本设计模型各组合间具有显著性差异，并且拟合有效；4因素中温度、时间及料液比对总蛋白的含量有显著的影响，而pH值对总蛋白含量的影响不显著。经拟合得到精提液总蛋白含量的回归方程为：总蛋白含量=25.80-0.75A-1.28B+1.24C-0.15D-0.52AB-0.24AC+0.13AD-0.74BC-0.35BD+0.82CD-0.92A2-2.23B2-1.97C2-1.87D2。通过软件求解方程，得出最优工艺条件为温度13.16 ℃，时间26.01 min，料液比1∶34(g∶mL)，pH7.03。在此条件下精提液中总蛋白的含量为26.387 mg。为检验模型的可靠性，实际精提实验结果为(26.483±0.392)mg，与理论预测值基本吻合。

3.6Vim的分离

精提物溶液经DEAE Sepharose FF柱，以梯度NaH2PO4缓冲液洗脱分离得到的UV检测线如图5所示。36—86 mmol/L缓冲液线性洗脱2 mL/管收集的馏分为第9—58管，图6显示以SDS-PAGE分析的第10—45管蛋白成分。以Western-Blot验证53 kD成分为Vim蛋白(图7)。第26—37馏分收集管Vim蛋白成分为电泳纯，合并予透析冻干获得纯化Vim蛋白干粉。

表1中心组合设计及检测结果

实验号ABCD总蛋白含量/mg12042.5406.514.62722042.5407.517.32131555.0307.015.05041530.0307.027.62051017.5407.523.1956155.0307.017.85071530.0507.020.70281017.5406.522.64591530.0307.026.080102017.5206.518.691111530.0107.014.215121530.0308.017.266132042.5207.015.92614530.0307.022.520152017.5407.522.880实验号ABCD总蛋白含量/mg161042.5407.519.708172530.0307.020.856181042.5206.519.406192017.5207.518.412201042.5207.517.051211042.5406.013.645221530.0307.024.763231017.5206.519.406241530.0306.017.968251530.0307.024.379261530.0307.026.675272017.5406.520.873281017.5207.518.786292042.5206.519.301

表2回归方程方差分析

方差来源平方和自由度均方F值P值显著性Model368.9851426.3560712.7038<0.0001极显著A-温度12.97519112.975196.2541280.0254显著B-时间38.70656138.7065618.656820.0007高度显著C-料液比35.47133135.4713317.097420.0010显著D-pH0.54473910.5447390.2625680.6163AB4.07341714.0734171.9634150.1829AC0.92222710.9222270.444520.5158AD0.28202510.2820250.1359380.7179BC8.28077618.2807763.991390.0655BD1.85010511.8501050.8917630.3610CD10.5761110.57615.0977520.0405显著A221.89678121.8967810.55440.0058显著B2129.29941129.299462.32318<0.0001极显著C2101.65931101.659349.00045<0.0001极显著D2101.93681101.936849.13421<0.0001极显著残差29.04524142.07466失拟21.84766102.1847661.2141670.4608不显著回归决定系数7.19757741.799394总离差398.030328

图5　36—86 mmol/L缓冲液线性洗脱的UV检测线

图6　线性洗脱第10-45管馏分电泳图

图7　第2，18，29，30，38，47，52管馏分的WB检测

3.7Vim的纯度及纯化效率

用10% SDS-PAGE纯化Vim溶液和精提物溶液，分析3组平行分离纯化实验结果(图8)。用Image Lab 4.0软件分析凝胶图像得到精提蛋白中Vim的纯度为6.94 %，纯化Vim冻干粉的Vim纯度为(80.66±1.30)%。计算相对回收率为(36.56±0.96)%(表3)。

M：Marker，S0：精提液，S1-3：纯化Vim图8　过柱前后样品电泳图

表3相对回收率分析

精提液蛋白质量/mg纯化蛋白质量/mg相对回收率/%42.501.37537.60242.381.32636.36941.031.26035.701

4　结论与讨论

本研究对以尿素缓冲液提取猪晶状体可溶性蛋白进行条件优化，得到最佳工艺条件为温度13.16 ℃，时间26.01 min，料液比1∶34(g∶mL)，pH 7.03。验证实验结果符合预期且优化条件容易实现。

本研究使用DEAE Sepharose FF柱一次过柱纯化Vim。实验初期曾以10—500 mmol/L NaH2PO4缓冲液以500倍柱体积洗脱分离Vim，结果显示Vim与2个主要杂蛋白被连续洗脱下来，42 kDa杂蛋白在36 mmol/L左右被洗脱，128 kDa杂蛋白在60 mmol/L左右被洗脱。从而确立以40倍以上柱体积的36 mmol/L NaH2PO4缓冲液洗脱大部分42 kDa杂蛋白。在线性洗脱阶段尝试仅用单一浓度缓冲液(58 mmol/L NaH2PO4，其余同BufferA)以100倍柱体积洗脱，其余步骤相同；结果显示馏分中仍含有大量杂蛋白，检测Vim纯度仅约为43%，分离纯化效果差。尝试线性洗脱更改为50倍柱体积，其余步骤相同；检测Vim纯度约为75%，用Buffer B继续洗脱仍见Vim和杂蛋白，此方法相对回收率低，蛋白提纯效率差。而以100倍柱体积用36—86 mmol/L NaH2PO4缓冲液线性洗脱能够将Vim与42 kDa和128 kDa杂蛋白较好地分离，Vim纯度达80%以上，相对回收率达36%以上，纯度达到市售进口Vim蛋白纯度水平。本研究提纯Vim的方法具有程序简捷、纯度高、相对回收率高的特点，可改变目前Vim蛋白稀缺的状况。

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Extraction and purification of soluble vimentin from porcine lens

CHENZhuo1,XIAChang2,AISi2,YULan1,FANGCheng1, 2

(1.School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China;2. School of Health Science and Nursing, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

This study is aimed to establish a purifying method of vimentin (Vim) extracted from porcine lens by once separation on column. The crude extracts of porcine lens were dissolved by refined extracting solution. The temperature, time, solid to liquid ratio and solution pH of refined extraction were optimized using single factor experiment and response surface analysis. Target protein was isolated and purified via DEAE Sepharose fast flow anion exchange column and Vim was identified by Western-Blot. The 10% SDS-PAGE was used to detect the purity and relative recovery rate. The optimized temperature, time, solid to liquid ratio and solution pH of refined extraction respectively were 13.16 ℃, 26.01min, 1:34(g:mL)and pH7.03. Followed elution with 36mmol/L NaH2PO4buffer of 40 times volume of the column, 36-86mmol/L NaH2PO4buffer of 100 times volume of the column was used to linear elution once for isolating and purifying Vim. Analyzing the electrophoretogram of 10% SDS-PAGE with Image Lab 4.0 software, the purity of Vim in purified lyophilized powder was (80.66 ± 1.30) % and the relative recovery rate was (36.56 ± 0.96) %.

pig; vimentin; extraction; purification

2016-06-01.

陈卓(1990-)，女，硕士研究生，Email:chenzhuoc@sina.com.

方成(1972-)，男，博士，副教授，Email:fang_cheng@foxmail.com.

湖北省自然科学基金(2015CFC845)；武汉轻工大学研究生创新项目(2013cx021).

2095-7386(2016)03-0029-06

10.3969/j.issn.2095-7386.2016.03.005

R 931.6

A