腈菌唑分子印迹固相萃取柱的制备及其在饲料检测中的应用

何丛薇，高林，赵春娟，高文惠*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）



腈菌唑分子印迹固相萃取柱的制备及其在饲料检测中的应用

何丛薇1，2，高林1，2，赵春娟1，2，高文惠1，2*

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050000；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

本实验在制备腈菌唑分子印迹固相萃取柱的基础上，建立了分子印迹固相萃取-高效液相色谱检测饲料样品中腈菌唑残留的方法。以腈菌唑为模板分子，运用本体聚合技术制备分子印迹固相萃取剂，装填成柱，使用该柱对饲料样品进行萃取净化，并采用高效液相色谱法对样品中腈菌唑残留进行检测。实验对固相萃取柱的制备条件和分离富集条件以及检测条件进行了研究。结果表明，采用本方法对样品处理选择性强，样品净化效果好；腈菌唑线性范围为0.3～200 μg/mL，平均回收率为88.6%～96.5%，相对标准偏差（RSDs）为1.54%～3.02%（n=5）。该方法能高选择性、灵敏、快速、准确地检测样品中腈菌唑残留。

饲料；腈菌唑；分子印迹聚合物；固相萃取柱；高效液相色谱法

腈菌唑属三唑类杀菌剂，具有内吸、保护和治疗性，被认为是一种前景较好的杀菌剂，近年来被广泛使用。但饲料中腈菌唑残留会直接或间接地对人体健康造成危害。为了最大限度地减小农药对人类的危害，建立高效、快速的农药残留分析方法是科学指导农药使用的关键技术之一。

分子印迹技术（MIT）是高分子科学、材料科学、生物化学等多学科相结合获得在空间结构和结合位点上与某一分子（模板分子）完全匹配聚合物的新实验制备技术。由于分子印迹聚合物（MIP）具有良好的物理化学稳定性，耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等恶劣环境的能力，容易保存，制备简便，易实现工业化生产，较好的使用寿命等优点（孟德欣等，2015），已在环境监测、食品安全、分离和色谱分析等领域得到广泛应用。其中，基于传统固相萃取而发展起来的分子印迹固相萃取技术（MISPET），是近年来分子印迹研究的热点之一（高文惠等，2014；胡静等，2012）。

本实验应用腈菌唑MIP制备分子印迹固相萃取柱，对饲料样品进行萃取净化，并利用高效液相色谱法对经过分子印迹固相萃取柱预处理的样品进行腈菌唑残留检测。

1　材料与方法

1.1材料与试剂腈菌唑（纯度为97.7%，江苏耕农化工有限公司）；丙烯酰胺（分析纯，天津金汇太亚化学试剂有限公司）；乙二醇二甲基丙烯酸酯（分析纯，抚顺安信化学有限公司）；偶氮二异丁腈（化学纯，天津市大茂化学试剂厂）；甲醇、乙腈（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；甲醇、乙腈、四氢呋喃、乙酸乙酯（分析纯，天津市大茂化学试剂厂）；实验用水为三蒸水。

腈菌唑标准储备液的配制：准确称取腈菌唑0.01 g，置于50 mL容量瓶中，用乙腈定容，配制成200 μg/mL标准储备液。

样品：猪饲料和牛饲料，均购自市场。

1.2仪器与设备LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）、ASE-12固相萃取仪（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）、TU-1810紫外可见分光光度计（北京普析通用有限责任公司）、KH5200型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）、HH-4型恒温水浴锅（江苏省金坛市宏华仪器厂）。

1.3方法

1.3.1分子印迹聚合物的制备将0.2 mmol腈菌唑和0.4 mmol丙烯酰胺（AM）放入50 mL的茄型瓶中，加致孔剂乙腈15 mL使其反应，超声1 h，再加交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）1.5 mL和引发剂偶氮二异丁腈（AIBN）0.02 g。超声30 min，混匀后通入N2脱氧15 min，再抽真空1 min后密封，在55℃恒温水浴振荡器中振荡24 h，得块状固体MIP。经研磨、粉碎，过200目筛，再用水沉降聚合物3次除去过细粉末。将最终得到的MIP颗粒用甲醇-乙酸（V∶V，95∶5）洗脱至无模板物质，然后用甲醇浸泡1 h除去残留的乙酸，洗脱后的聚合物放入真空干燥器中干燥6 h（45℃），得到以腈菌唑为模板分子的聚合物MIP。

1.3.2固相萃取柱的制备将制备好的腈菌唑MIP放入水中进行沉降，充分去除过细粉末，然后均匀地填充到固相萃取柱中，在顶端加上少许脱脂棉，并轻轻按压使填料紧实，使装柱高度为2 cm。

将转为H型的732型阳离子树脂、大网孔吸附树脂和硅胶三种填料分别填装进具砂芯层析柱内，在顶端加少许脱脂棉，并轻轻按压使填料紧实，使填料高度为2 cm。

1.4色谱条件色谱柱：Promosil C18（150 mm× 4.6 mm，5 μm），检测波长210 nm，流动相为甲醇-水（V∶V，80∶20），流速1 mL/min，柱温25℃。

1.5样品提取参照刘博等（2013）的方法，称取5.000 g样品，捣碎，用20 mL乙腈溶解（提取两次），混匀，超声15 min，于4000 r/min离心10 min，吸取上清液1 mL过分子印迹固相萃取柱，用20 mL水淋洗，待排净淋洗液后，用10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用甲醇定容10mL后待测。

1.6分离富集（1）柱子活化。先用10 mL水将柱子浸湿，再用10 mL甲醇过柱，最后用10 mL水过柱。（2）上样。吸取样液1 mL上柱，控制固相萃取仪压力为45 kPa。（3）淋洗。当待测液全部过柱后，用20 mL水淋洗。（4）洗脱。用10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，过0.45 μm的微孔滤膜，滤液待液相色谱分析。

2　结果与分析

2.1固相萃取柱装柱高度的选择本实验比较了腈菌唑分子印迹固相萃取柱装柱高度分别为1、2、3 cm时柱对样品的净化和吸附能力的影响。当装柱高度大于3 cm时，柱压增加，需要在更高的压力下进行洗脱，这样既耗费洗脱剂，又会增加洗脱时间。当装柱高度为1 cm时，模板物质不能全部被吸附在萃取柱上，即柱吸附容量偏低。当装柱高度为2 cm时，与3 cm柱高相比，吸附、净化效果相当，且这时柱压较低，操作方便快速，因此选择装柱高度为2 cm。

2.2固相萃取柱柱压的选择本实验考察了柱压分别为10、20、30、45、55 kPa时对样品净化效果的影响。实验结果显示，在10、20、30、45 kPa柱压下，样品的净化效果相同，但柱压越低，样品处理速度越慢。而在55 kPa柱压下，过液速度大于目标物在聚合物上的解析速度，当洗脱液全部通过后，目标物在聚合物中仍有残留，导致洗脱效果差。因此为了节省前处理时间提高效率，选择45 kPa柱压下进行样品前处理。

2.3淋洗液用量的选择选用填料高度2 cm的分子印迹固相萃取柱对样品进行萃取净化处理，以水作为淋洗剂，考察了不同用量的淋洗剂对样品中杂质的淋洗效果。于固相萃取柱中加入1 mL样品原液，分别用5、10、15、20、25 mL的水进行淋洗，收集各淋洗液，用高效液相色谱仪检测。结果为淋洗液用量是20 mL时，不仅能将样品中杂质淋洗干净，同时也不会造成淋洗液的浪费。

2.4洗脱剂及其用量的选择本实验考察了甲醇和乙腈两种洗脱剂，并在其他条件相同的情况下进行洗脱，将收集的洗脱液上机检测，按照1.4色谱条件测定。由图1看出，甲醇的洗脱能力强于乙腈，兼顾溶剂毒性和价格因素，因此选择甲醇为洗脱剂。

图1　不同洗脱液色谱图

为考察了不同用量的洗脱剂对样品中目标物质的萃取效果的影响。向固相萃取柱中加入1 mL浓度为200 μg/mL的标准储备液，分别用5、10、15、20、25 mL的甲醇进行洗脱，收集各洗脱液，用高效液相色谱仪进行检测。结果表明，当洗脱液用量大于10 mL时，已经不能检测到目标物质，说明10 mL洗脱液可以完全将目标物质洗脱下来，并且不会造成洗脱剂的浪费，故本实验最佳洗脱剂用量为10 mL。

2.5不同固相萃取柱萃取效果的比较实验以阳离子交换树脂、大网孔吸附树脂、硅胶以及腈菌唑分子印迹聚合物分别作为固相萃取剂，比较其对腈菌唑的吸附能力，按照1.4色谱条件测定。

将200 μg/mL的腈菌唑标准储备液上样1 mL，用20 mL水淋洗，10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液待上机检测。

由图2可知，腈菌唑分子印迹固相萃取柱对腈菌唑的吸附能力最高，表明腈菌唑分子印迹固相萃取柱对腈菌唑具有优越的吸附性能，其主要原因是该柱对模板物质具有特异性识别能力，所以对模板物质的选择吸附能力强。

图2　腈菌唑过柱后洗脱液色谱图

2.6液相色谱流动相的选择本实验采用甲醇-水作为流动相，分别考察了不同配比的甲醇-水（体积比分别为100∶0、90∶10、80∶20和70∶30）对腈菌唑保留行为的影响。当流动相中甲醇比例较高（100%甲醇或90%甲醇）时，腈菌唑出峰快；甲醇与水体积比较小时（70∶30），则腈菌唑保留时间偏长；当甲醇与水体积比为80∶20时，腈菌唑保留时间适宜，不易受溶剂影响，如图3所示。因此，本实验选择体积比为80∶20的甲醇-水为流动相。

2.7线性关系与检出限将腈菌唑储备液分别配制成质量浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/mL的系列标准溶液，在1.4色谱条件下进行测定，然后绘制腈菌唑的线性关系曲线。结果表明，线性方程为y=32466.17x+23454.15（R=0.9999），线性范围为0.3～200 μg/mL，检出限为0.1 μg/mL。可见，腈菌唑线性范围宽，检测灵敏度较高。

图3　腈菌唑标准溶液色谱图

2.8腈菌唑分子印迹固相萃取柱对样品净化和吸附能力测定分子印迹固相萃取柱利用非共价键对目标物吸附，通过淋洗剂将杂质去除，再使用洗脱剂将目标物洗脱下来。从图4与图5对比可知，分子印迹固相萃取柱对样品净化效果好，对杂质不具有吸附能力。从图6可知，分子印迹固相萃取柱只对模板物质有吸附作用，表现出其从复杂基质中特异性分离富集目标物的优越性能。

图4　牛饲料样品提取液色谱图

图5　牛饲料样品提取液过柱后洗脱液色谱图

图6　牛饲料样品加标提取液过SPE柱后洗脱液色谱图

2.9回收率和精密度实验采用本方法对猪饲料和牛饲料样品在2 μg/mL和100 μg/mL 2个添加水平下，进行加标回收率实验，分析结果如表1所示。由表1可见，样品平均回收率为88.6%～96.5%，相对标准偏差（RSDs）为1.54%～3.02%（n=5）。说明方法的回收率和精密度良好。

表1　样品回收率和精密度实验（n=5）%

3　结论

本实验以自制的腈菌唑分子印迹聚合物为固相萃取材料，对样品进行前处理，并利用高效液相色谱法测定样品中腈菌唑杀菌剂残留。结果表明，利用此分子印迹固相萃取柱对样品进行前处理，样品净化效果好，对腈菌唑特异吸附性强。腈菌唑的线性范围为0.3～200 μg/mL，线性相关系数为0.9999，检出限为0.1 μg/mL；对食品和饲料样品进行分析，平均回收率为88.6%～96.5%，相对标准偏差（RSDs）为1.54%～3.02%（n=5）。该方法可应用于质检和相关单位对食品或饲料中腈菌唑杀菌剂残留的监测。

［1］高文惠，王姣姣，贾英民.分子印迹固相萃取-液相色谱法测定食品中硝基呋喃类药物残留［J］.中国食品学报，2014，14（9）：183～189.

［2］胡静，吴晓燕，高文惠.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法分析2种三唑类杀菌剂残留［J］.药物分析杂志，2012，32（6）：1043～1047.

［3］刘博，尹航，刘文红，等.分子印迹固相萃取-高效液相色谱法检测饲料中联苯三唑醇［J］.中国饲料，2013，15：33～34，43.

［4］孟德欣，刘志双，于文瑄，赵宁.新型分子印迹聚合物的合成及其在食品安全中应用的现状［J］.科技视界，2015，20：17～18.

On the basis of preparation of myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction column，a method for determination of myclobutanil residues in feed samples was established by molecularly imprinted solid phase extraction-high performance liquid chromatography.Myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction agent was synthesized by bulk polymerization using myclobutanil as template molecule，and used to prepare myclobutanil molecularly imprinted solid phase extraction column.The extraction column was used to enrich myclobutanil in samples and cleanse samples，the cleaned samples were detected by high performance liquid chromatography.The selection of the extraction column preparation conditions，separation and enrichment conditions and detection conditions were investigated.The result showed that the method has good cleaning sample effect and strong selectivity，the linear range of myclobutanil was 0.3～200 μg/mL，the average recoveries were 88.6%～96.5%，the relative standard deviations（RSDs）were 1.54%～3.02%（n= 5）.The method was highly selective，sensitive，fast and accurate for determination of myclobutanil residues in samples.

feed；myclobutanil；molecularly imprinted polymer；solid phase extraction column；high performance liquid chromatography

S816.17

A

1004-3314（2016）01-0024-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20160108

河北省科技支撑计划项目（14227504D、14236602D-13）