CARD9在老年急性胰腺炎发病早期阶段的作用

许宏敏

(天津市第三中心医院，天津　300170)



CARD9在老年急性胰腺炎发病早期阶段的作用

许宏敏

(天津市第三中心医院，天津300170)

目的探讨CARD9在老年急性胰腺炎发病早期阶段的作用机制。方法选取98例老年急性胰腺炎患者，其中66例为轻症急性胰腺炎(MAP)、32例为重症急性胰腺炎(SAP)，入院后第1、3、5天分别收集外周静脉血；选取40名健康志愿者为对照组，入组时收集外周静脉血。密度梯度法离心分离单个核细胞；Western印迹检测急性胰腺炎患者单个核细中CARD9、Bcl-10表达水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平；免疫共沉淀法和免疫荧光检测对照组、MAP组、SAP组入院第1天的CARD9、Bcl-1共定位、表达、结合情况。结果SAP组入院第1天的p65 NF-κB水平明显高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)；SAP组入院第3天的p65 NF-κB水平明显高于对照组和MAP组第3、5天(P<0.05)。SAP组入院第1、3天的p38 MAPK水平明显高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)。SAP组入院第1、3、5天的CARD9、Bcl-10水平分别高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)。治疗后MAP组入院第5天的CARD9水平明显低于第1天(P<0.05)。以IgG为阴性对照，SAP组灰度值明显高于MAP组和对照组(P<0.05)。SAP组CARD9、Bcl-10共表达细胞数和荧光强度均明显高于MAP组和对照组；MAP组高于对照组，且第5天荧光强度与第1天相比明显降低；SAP组第5天荧光强度仍明显高于MAP组和对照组。p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平与CARD9表达呈正相关; p38 MAPK磷酸化水平与CARD9表达呈正相关。结论CARD9在老年急性胰腺炎疾病中通过激活NF-κB、MAPK信号通路诱导炎症因子产生。

急性胰腺炎；CARD9；NF-κB；MAPK

老年急性胰腺炎(AP)患者病情有快速发展为重症的可能性，导致严重并发症，目前临床仍缺乏有效的积极干预措施。研究已证实，单核-巨噬细胞系统激活是AP发展的启动因子〔1〕。巨噬细胞中CARD9是一种高表达的新型衔接蛋白，可抵抗细菌和真菌感染，通过Bcl-10形成复合物激活下游核转录因子(NF)-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路〔2〕。在大鼠模型中可通过抑制NF-κB和p38信号传导因子减轻重症AP(SAP)的严重程度〔3〕。CARD9在AP发病早期表达上升，但其在AP中的作用仍未明确。因此，本研究检测老年AP患者外周血单个核细胞中CARD9、Bcl-10表达水平，同时检测CARD9下游信号分子p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平，探讨其相关性。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2014年10月至2015年10月本院收治的98例老年AP患者。其中66例为轻症急性胰腺炎(MAP)，男30例，女36例，年龄60～74〔平均(67.14±3.50)〕岁。32例为SAP，男22例，女10例，年龄60～76〔平均(68.53±4.15)〕岁。均给予抑制胰酶分泌、补液、禁食等常规治疗，选择性给予抗感染治疗。选取40名健康志愿者为对照组，男18例，女22例，年龄60～75〔平均(66.79±3.86)〕岁。三组患者性别构成、年龄无统计学差异(P>0.05)。所有入选受试者均签署知情同意书；均无自身免疫性疾病、慢性感染性疾病、恶性肿瘤等对检测指标有影响的疾病。

1.2外周血单个核细胞分离和蛋白提取患者入院第1、3、5天分别抽取肘静脉血5 ml，对照组入组时取肘静脉血5 ml，收集到的血液标本均在6 h内完成单个核细胞分离。密度梯度法离心分离单个核细胞，磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，使用总组蛋白提取试剂盒(上海拜力生物科技有限公司)提取蛋白：每份单个核细胞标本中加入100 μl裂解缓冲液，冰上充分裂解，10 000 r/min离心60 s，弃上清后加入50 μl裂解缓冲液，冰上充分裂解，10 000 r/min离心5 min，取上清，-20℃保存，用于后续实验。

1.3Western印迹检测检测外周血单个核细胞中CARD9、Bcl-10表达水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平。50 μg蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)电泳分离，半干法转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室温下5%脱脂牛奶封闭PVDF膜60 min，加一抗(1∶1 000稀释)，4℃孵育过夜。Tris盐酸缓冲液TBST洗膜3次，10 min/次，加二抗(1∶1 000稀释)，室温下孵育60 min，清洗后增强化学发光法(ECL)化学发光试剂显色，Image J 软件分析蛋白条带灰度值。

1.4免疫共沉淀取0.2～500.0 μl总蛋白样本加入2 μg兔多克隆抗体Bcl-10，4℃摇床过夜；加入20 μl混悬完全的蛋白A+琼脂糖G，4℃摇床5 h。10 000 r/min离心10 min，弃去上清；PBS洗涤沉淀3次，弃去上清，SDS-PAGE电泳上样缓冲液，重悬沉淀。水浴5 min，取部分样品行SDS-PAGE电泳分离，转移到硝酸纤维素膜，鼠单抗CARD9为一抗，行Western印迹检测。用1 μg普通IgG和20 μl混悬完全的蛋白A+琼脂糖G重复上述操作，作为阴性对照。用外周血单个核细胞中提取的总蛋白重复上述操作，作为阳性对照。

1.5免疫荧光检测检测CARD9、Bcl-10共定位和表达情况。外周血单个核细胞用0.02 mol/L PBS混悬、离心，弃去上清，加200 μl的PBS混悬，取50 μl置于防脱载玻片，室温下静置备用。4%多聚甲醛溶液固定，PBS洗涤后加一抗(CARD9、Bcl-10抗体)，4℃孵育过夜。PBS洗涤后加荧光二抗〔CARD9抗体为羊抗鼠辣根过氧化物酶(HRP)、Bcl-10抗体为羊抗兔HRP〕，4℃孵育60 min，封片后荧光显微镜拍摄。绿色荧光：CARD9图像；红色荧光：Bcl-10图像；蓝色荧光：细胞核图像；黄色荧光：CARD9与Bcl-10融合图像。

1.6统计学方法应用SPSS20.0软件，计量资料多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较进行t检验，相关性进行Pearson分析。

2　结　果

2.1磷酸化p65 NF-κB、p38 MAPK水平三组p65 NF-κB、p38 MAPK水体总体比较均有统计学差异(P<0.05)。SAP组入院第1天的p65 NF-κB水平明显高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)；SAP组入院第3天的p65 NF-κB水平明显高于对照组和MAP组第3、5天(P<0.05)。SAP组入院第1、3天的p38 MAPK水平明显高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)。见图1，表1。

图1　Western印迹检测三组各研究指标蛋白表达

组别nCARD9Bcl-10磷酸化p65NF-κB磷酸化p38MAPK对照组400.34±0.051.13±0.221.28±0.220.69±0.35MAP组66入院第1天0.72±0.031)1.26±0.141.39±0.280.97±0.13入院第3天0.56±0.081.18±0.181.17±0.250.88±0.20入院第5天0.26±0.101.12±0.150.98±0.180.84±0.31SAP组32入院第1天1.13±0.061)2)1.85±0.171)2)1.75±0.061)3)1.99±0.161)2)入院第3天1.05±0.041)2)1.83±0.201)2)1.66±0.041)3)1.79±0.221)2)入院第5天1.02±0.021)2)1.71±0.251)2)1.49±0.251.37±0.45

与对照组相比：1)P<0.05；与MAP组同时间点相比：2)P<0.05；与SAP组同时间点相比：3)P<0.05

2.2CARD9、Bcl-10表达水平比较三组CARD9、Bcl-10水平总体比较均有统计学差异(P<0.05)。SAP组入院第1、3、5天

的CARD9、Bcl-10水平分别高于对照组和MAP组第1、3、5天(P<0.05)。治疗后MAP组入院第5天的CARD9水平明显低于第1天(P<0.05)。

2.3免疫共沉淀检测以IgG为阴性对照，三组入院第1天的外周血单个核细胞中均可检测到CARD9-Bcl-10复合体，SAP组灰度值明显高于MAP组和对照组(P<0.05)。见表2，图2。

图2　抗CARD9和抗Bcl-10的免疫共沉淀分析

组别n阴性对照阳性对照CARD9-Bcl-10复合体对照组400.00±0.001314.70±152.232692.33±19.98MAP组660.00±0.003334.92±95.281)2352.21±50.53SAP组320.00±0.004460.79±100.491)5535.67±175.901)2)

与对照组相比：1)P<0.05；与MAP组相比：2)P<0.05

2.4免疫荧光检测CARD9、Bcl-10主要共定位于外周血单个核细胞质内，SAP组CARD9、Bcl-10共表达细胞数和荧光强度均明显高于MAP组和对照组；MAP组高于对照组，且第5天荧光强度与第1天相比明显降低；SAP组第5天荧光强度仍明显高于MAP组和对照组。见图3。

2.5CARD9、Bcl-10表达与p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平相关性分析Pearson相关性分析显示，老年AP患者外周血单个核细胞中p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平与CARD9表达呈正相关(r=0.781、0.849，P<0.01);p38 MAPK磷酸化水平与CARD9表达呈正相关(r=0.717，P<0.01)。

A～C为对照组CARD9、Bcl-10、融合图像；D～F为MAP组第1天CARD9、Bcl-10、融合图像；G～I为MAP组第3天CARD9、Bcl-10、融合图像；J～L为MAP组第5天CARD9、Bcl-10、融合图像；M～O为SAP组第1天CARD9、Bcl-10、融合图像；P～R为SAP组第3d CARD9、Bcl-10、融合图像；S～U为SAP组第5天CARD9、Bcl-10、融合图像图3　三组细胞免疫荧光检测(×400)

3　讨　论

CARD9参与机体识别细菌、真菌、病毒等病原体，在机体免疫反应中发挥关键作用；而NF-κB、p38通路需要CARD9参与〔4〕。在病原菌感染的CARD9缺陷型小鼠体内的IL-6、TNF-α水平明显降低，机体抗病原菌能力降低，小鼠死亡率提升〔5〕。体内抗细菌、真菌感染时，Dectin-1可诱导细胞内依赖CARD9信号级联反应，进而激活NF-κB通路生成细胞因子〔6〕。细菌感染时，NOD样受体、TLR4可经CARD9依赖途径激活p38蛋白和MAPK通路。微生物刺激下CARD9-Bcl-10复合体是生成炎性因子的重要环节。

目前研究认为，AP早期为非感染性炎症反应，可能分泌诱导PBMC活化的内源性物质〔7〕。提示CARD9蛋白表达在AP患者PBMC中可能具有不同的作用机制。相关研究发现，AP初期CARD9表达明显升高，恢复期逐渐降低〔8〕，但具体作用机制仍未明确。本次研究显示，SAP患者CARD9蛋白表达水平和p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平均明显高于对照组，说明CARD9蛋白在AP发生、发展中具有重要地位。相关性分析显示，p65 NF-κB、p38 MAPK磷酸化水平与CARD9表达呈正相关，可推测CARD9在AP病情发展中激活NF-κB、MAPK通路来诱导炎性因子产生。本次研究显示，在AP发病早期，Bcl-10蛋白变化趋于与CARD9相同，免疫荧光和免疫共沉淀技术进一步探究发现，AP患者外周血单个核细胞中CARD9能够与Bcl-10相结合，在胞内共表达，说明SAP患者中存在CARD9-Bcl-10复合体诱导的NF-κB、MAPK信号通路活化。

综上，老年SAP患者外周血单个核细胞中CARD9与NF-κB、MAPK活化水平呈正相关，能够与Bcl-10结合，激活下游NF-κB、MAPK信号通路，为老年AP干预治疗提供新的靶点。

1Sakai A，Nishiumi S，Shiomi Y，etal.Metabolimic analysis to discover candidate therapeutic agents against acute pancreatitis〔J〕.Arch Biochem Biophys，2012；522(2):107-20.

2Shen JQ，Shen J，Wang XP，etal.Expression of insulin-like growth factor binding protein-4 (IGFBP-4) in acute pancreatitis induced by l-arginine in mice〔J〕.Acta Histochem,2012；114(4):379-85.

3Biradar S，Veeresh B.Protective effect of lawsone on L-Arginine induced acute pancreatitis in rats〔J〕.Indian J Exp Biol，2013；51(3):256-61.

4Yang R，Jing ZL，Zhang XM，etal.MR imaging of acute pancreatitis: correlation of abdominal wall edema with severity scores〔J〕.Eur J Radiol，2012；81(11):3041-7.

5Tang W，Zhang XM，Xiao B，etal.Magnetic resonance imaging versus acute physiology and chronic healthy evaluation Ⅱ score in predicting the severity of acute pancreatitis〔J〕.Eur J Radiol，2011；80(3):637-42.

6Cho YS，Kim HK，Jang EC，etal.Usefulness of the bedside index for severity in acute pancreatitis in the early prediction of severity and mortality in acute pancreatitis〔J〕.Pancreas，2013；42(3):483-7.

7Abu-El-Haija M，Lin TK，Palermo J，etal.Update to the management of pediatric acute pancreatitis: high lighting areas in need of research〔J〕.J Pediatr Gastroenterol Nutr，2014；58(6):689-93.

8Jang JW，Kim MH，Jeong SU，etal.Clinical characteristics of intraductal papillary mucinous neoplasm manifesting as acute pancreatitis or acute recurrent pancreatitis〔J〕.J Gastroenterol Hepatol，2013；28(4):731-8.

〔2015-12-15修回〕

(编辑袁左鸣)

天津市科委基础项目(No.14JCYBJC25701-1)

许宏敏(1972-)，女，主管技师，主要从事血液学及凝血研究。

R57

A

1005-9202(2016)17-4258-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.061