人工虫草对2型糖尿病早期肾病辅助T细胞1/2平衡的影响

吴晓燕　汤旭磊　傅松波　吕海宏　刘丽娟

(兰州大学第一医院内分泌科，甘肃　兰州　730000)



人工虫草对2型糖尿病早期肾病辅助T细胞1/2平衡的影响

吴晓燕汤旭磊傅松波吕海宏刘丽娟

(兰州大学第一医院内分泌科，甘肃兰州730000)

目的探讨人工冬虫夏草(简称虫草)对早期2型糖尿病肾病(T2DN)患者辅助T细胞(Th)1/2细胞的影响。方法选择60例T2DN患者，随机分为两组，虫草治疗组30例，在原用药物基础上加用人工虫草(金水宝胶囊)3粒，每天3次，口服，连用12 w。常规治疗组30例，原用药继续，不加用虫草。健康对照组20例。检测T2DN患者治疗前后及健康受检者外周血Th、24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)及高敏C反应蛋白(hs-CRP)的表达。结果T2DN组外周血CD4+IFN-γ T1细胞，Th1/Th2比值，hs-CRP，UAER均高于健康对照组(P<0.05)；T2DN组CD4+IL-4 Th2细胞低于健康对照组(P>0.05)；虫草治疗组治疗后外周血CD4+IFN-γ T细胞，Th1/Th2比值，hs-CRP，UAER较常规治疗组下降更明显(P<0.05)，CD4+IL-4 Th2细胞数较常规治疗组升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论虫草通过调节T2DN患者外周血Th1/Th2 淋巴细胞的失衡，减轻其免疫炎症反应，从而减轻尿白蛋白的排出，有利于早期肾功能的恢复。

2型糖尿病；糖尿病肾病；冬虫夏草;T辅助细胞

早期糖尿病肾病(DN)如能及时治疗，肾小球结构及功能可恢复正常，而发展至临床DN期，则肾损害为不可逆性。近年来的研究表明2型糖尿病肾病(T2DN)存在着明显的免疫异常〔1〕。研究发现冬虫夏草具有明显的免疫调节及减轻蛋白尿的作用〔2〕，本研究通过测定虫草治疗前后T2DN患者外周血中的辅助T细胞(Th)1 、Th2，高敏C反应蛋白(hs-CRP)及尿24 h尿微量白蛋白排泄率(UAER)的变化，探讨虫草对T2DN患者的Th1/Th2平衡的免疫调节作用。

1　资料与方法

1.1一般资料健康对照组：20例，男12例，女8例，健康体检者，平均年龄(50.5±6.0)岁，汉族，无糖尿病及其他自身免疫性疾病。T2DN组：60例，根据1999年WHO糖尿病诊断标准和Mogensen DN分期标准，确诊早期DN(UAER 20～200 μg/min)60例，男32例，女28例，年龄(50.9±8.7)岁，病程(10.3±3.5)年。系本院内分泌科住院患者，T2DN患者随机分为两组，虫草治疗组30例，在原用药物基础上加用人工虫草金水宝胶囊(江西济民可信药业有限公司，批号120502)3粒/次，3次/d，口服，连用12 w。常规治疗组30例，原用药继续，不加用虫草。入组患者均无糖尿病急慢性并发症,也无自身免疫性疾病，感染，肿瘤，心力衰竭、高血压，肝脏损害、泌尿系统感染、肾结石及其他肾脏疾病；近期未使用肾毒性药物。所有病例不存在其他因素引起的蛋白尿。

1.2试剂与仪器PERCP标记的抗CD4单抗，PE标记的抗IL-4单抗，PITC标记的抗IFN-γ单抗(均为鼠抗人)。FITC和 PE，PERCP标记的鼠IgG1同型对照免疫球蛋白，佛波醇乙酯(PMA)，离子霉素(ionomycin)，布雷菲德菌素A(BFA)和Fix&Perm破膜剂均购自美国Caltag公司。hs-CRP试剂盒：晶美生物工程有限公司。流式细胞仪为美国Coulter公司EPICS-XL型。

1.3方法

1.3.1试验设计对符合条件的60例患者，全部病例均给予低盐、低蛋白糖尿病饮食，继续应用原降糖药物将空腹血糖(FBG)控制在5.6～7.0 mmol/L，餐后2 h血糖<10 mmol/L为满意。检测患者入组时及治疗12 w后及健康受检者外周血Th淋巴细胞亚群、血清hs-CRP水平和24 h尿微量白蛋白(UMA)定量，血清尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)，并记录体重变化。

1.3.2Th1/Th2流式细胞术检测 肝素抗凝血5 ml,淋巴细胞分离液分离单核细胞，将细胞数调整至1×106/ml，将细胞悬液加入24孔细胞培养板中，加入刺激剂PMA(20 ng/ml)，离子霉素(1 μg /ml)和蛋白质转运抑制剂BFA(2 μg /ml)以阻止细胞因子向细胞外分泌。37℃,5%CO2环境下培养5 h，对细胞表面抗原进行染色，加入破膜剂进行固定-破膜打孔以利于细胞因子单抗进入细胞，进行细胞内细胞因子染色，每管加入10 μl INF-γ单抗和IL-4单抗，以相应的同种型对照IgG单抗作对照染色，应用流式细胞仪对分泌INF-γ的CD4+Th1和分泌IL-4的CD4+Th2进行检测。

1.3.3血清hs-CRP、UAER的测定取晨起空腹静脉血2 ml,用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定。正常参考值为254～16 104 ng/ml。UAER免疫分析法，德国Bayer公司DC2000型检测仪及检测试剂盒。

1.4统计学方法采用SPSS8.0软件进行单因素方差分析。

2　结　果

所有T2DN患者Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP浓度,24 h UAER均显著高于健康对照组(P<0.05),Th2与健康对照组无显著差异(P>0.05)。虫草治疗后与治疗前相比Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP浓度，24 h UAER显著下降(P<0.05)。而常规治疗组治疗后Th1百分比，Th1/Th2比值，血清hs-CRP浓度，24 hUAER较治疗前有所下降，但无统计学差异(P>0.05)，虫草治疗组及常规治疗组Th2百分比治疗前后均无统计学差异(P>0.05)。两组患者血肌酐及尿素氮治疗前后无明显变化(P>0.05)。见表1。

表1　各组临床及实验室资料比较±s)

与健康对照组比较：1)P<0.05；与本组治疗前比较：2)P<0.05

3　讨　论

DN的发病机制尚未完全清楚。近来研究发现免疫因素可能是其发生的一个重要原因〔3,4〕。研究发现早期DN存在 Th1/Th2的失衡〔5〕。因此研究DN Th1与Th2的平衡的意义及调整Th1/Th2平衡有助于更深入的探索DN治疗的新途径。

CD4+Th是构成机体免疫系统的一种主要细胞，Th1主要负责细胞免疫及炎症反应，Th2与体液免疫有关〔6〕。生理条件下，机体的Th1和Th2处于相对平衡状态，在疾病状态下，这种平衡被打破，Th1，Th2所致不同优势免疫应答与疾病的发生、发展、预后有关〔7〕。近年研究发现，多种肾脏疾病存在Th1、Th2的失衡。在慢性肾功能不全的患者Th1处劣势，Th1/Th2比值下降〔8〕。但也有相反的报道，新月体肾炎、类风湿关节炎相关性肾炎、由Th1应答介导〔9〕。Th1/Th2与DN的关系日益受到关注，但目前报道比较少。

本研究发现，早期T2DN患者的Th1、Th1/Th2比值和hs-CRP均高于健康对照组。相似的报道也见于其他肾脏疾病，有研究发现，在Ⅳ型狼疮性肾炎患者中Th1/Th2比值是升高的，主要以Th1升高为主，这与Ⅳ型狼疮性肾炎是以免疫复合物沉积介导的免疫反应是相一致的〔10〕，也与邱明才等〔11〕通过对DN患者肾活检发现,沿肾小球、肾小管、肾间质和毛细血管有免疫复合物的沉积相一致,根据以上结果推测早期T2DN患者存在Th1/Th2的失衡，机体免疫系统的激活产生的炎症因子可导致血管内皮的损伤，进而促进血管并发症的发生、发展。免疫炎症可能介导了早期DN的发生。研究表明，人工虫草(金水宝)治疗DN蛋白尿的有效率是对照组有效率的3.34倍〔12〕，是一种很有前景的治疗DN的药物。金水宝胶囊是采用生物工程方法分离的冬虫夏草菌种经低温发酵精心研制的纯中药制剂，与天然虫草主要成分一致〔13〕。临床研究报道，虫草真菌有较强的免疫抑制作用，能抑制特异性抗体的产生，能抑制网状内皮系统的吞噬作用，具有抗炎及免疫调节作用〔14〕。本临床研究发现，早期T2DN患者给予人工虫草治疗12 w后,治疗前后自身对照,发现Th1细胞百分比，Th1/Th2 比值，血清hs-CRP浓度，24 h UAER较治疗前有所下降，而常规治疗组治疗后上述指标有所下降，但无统计学意义。

综上，T2DN患者经虫草治疗后，肾脏免疫炎症减轻可能是通过影响Th亚群的平衡来实现的，具体机制有待进一步研究。而金水宝胶囊作为DN的一种有效辅助治疗药物，对于改善DN的预后具有重要意义。

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〔2015-01-16修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

汤旭磊(1958-)，男，博士，教授，博士生导师，主要从事内分泌代谢病的研究。

吴晓燕(1969-)，女，硕士，副主任医师，主要从事2型糖尿病发病机制的研究。

R392.6

A

1005-9202(2016)17-4216-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.038