人乳头瘤病毒16亚型LAMP检测法的建立

薛德冬　张　静　高丽娜　梁　迪

(山东省胜利油田医院药剂科，山东　东营　257055)



人乳头瘤病毒16亚型LAMP检测法的建立

薛德冬张静1高丽娜2梁迪3

(山东省胜利油田医院药剂科，山东东营257055)

目的本研究旨在建立一种简单、快速、灵敏的检测方法，使环介导等温扩增技术(LAMP)应用于HPV16亚型的检测。方法根据GenBank登录的HPV16亚型序列(FJ610152)中E7基因序列设计了多套特异引物，通过LAMP real-time Turbidimeter仪对HPV16亚型的LAMP引物进行筛选并对反应体系和反应条件进行检测和实时监控以检测其特异性和敏感性。反应结束后加入SYBR Green I染料肉眼判定并与仪器检测结果进行比对。结果建立的LAMP方法在61℃下可对HPV16核酸进行高效扩增，反应结束后加入染料肉眼判定结果与Real-time Turbidimeter仪检测结果一致；该方法具有较强的特异性和较高的敏感性(最低检出限量为3.0×103 copies/μL)。LAMP法与HPV分型试剂盒对35份样品的检测结果一致。结论本研究建立的可视化LAMP方法操作简便，适用于HPV16的快速检测。

人乳头瘤病毒；环介导等温扩增技术

人乳头瘤病毒(HPV)是乳多空病毒科多瘤病毒亚科的一种小型双链环状DNA 病毒。HPV 感染能引起宫颈癌、生殖器疣等多种性传播疾病，每年因感染HPV致癌死亡人数居高不下，HPV已成为潜在的隐形杀手，严重危害人类健康〔1，2〕。HPV主要分为高危型和低危型，报道高危型HPV16相关宫颈癌早期诊断率低，宫颈癌癌前病变进程更快，HPV16也是宫颈癌再发的独立危险因素〔3〕，感染HPV16或HPV18的女性，其病程发展至宫颈癌前病变的风险远高于未感染者〔4〕。另据研究表明，宫颈癌患者中70%由高危型HPV16和18感染引起，因此对HPV高危型的及时检测对于在宫颈癌未发生前做出积极治疗具有现实意义。环介导等温扩增技术(LAMP)为Notomi于2000年发明的新型检测技术〔5〕，其原理是针对六个不同区域设计了4条引物对核酸进行恒温扩增，现已被广泛应用到病毒、细菌、寄生虫等领域。SYBR Green I是一种双链DNA染料，当结合了DNA双链时即可发出荧光，利用此特性建立可视化的环介导等温扩增技术使结果更加一目了然。本试验针对HPV 16 E7基因设计了4条特异性引物(F3、B3、FIP、BIP)，恒温下对HPV16进行扩增，通过LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter仪对反应进程进行监测建立环介导等温扩增方法，旨在为基层医院预防宫颈癌做出贡献。

1　材料与方法

1.1材料DNA LAMP Kit、LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter仪购自日本荣源株式会社；Multiskan spectrum紫外分光光度计；SYBR Green I购自Invitrogen公司；12份已知的单重感染12不同HPV亚型的宫颈刮片样本及35份未知的宫颈刮片临床样本来自长春市人民医院，患者年龄为25～47岁。样本均为专用宫颈刷收集的宫颈分泌物，12份单重感染HPV亚型的临床样品由广东凯普HPV分型试剂盒确认。

1.2LAMP引物设计采用Primer Explorer V4软件，根据GenBank登录的HPV16亚型序列(FJ610152)中E7基因设计多套特异引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成。经初步筛选后得到一套效果最佳引物，见表1。

表1　HPV16亚型LAMP检测引物序列

1.3HPV基因片段合成和纯化及定量以Qiagen DNA提取试剂盒提取HPV6亚型宫颈刮片样本DNA为模板，以HPV LAMP引物的外引物F3和B3为PCR的引物进行PCR扩增，反应条件：95℃预变性5 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循环35次；末次循环72℃延伸5 min。扩增产物经回收后克隆至pMD18-T载体，转化至感受态细胞DH5α中后置于氨苄抗性的LB固体培养基中37℃培养12～16 h，蓝白斑筛选重组质粒pMD18-T-HPV16，挑取白斑进行菌落PCR，采用Omega Biotek质粒小量提取试剂盒I型提取重组质粒，用紫外分光光度计测定其浓度。

1.4LAMP检测HPV特异性按Qiagen DNA提取试剂盒说明书分别提取单重感染的12种不同HPV亚型(HPV6、11、42、43、16、18、26、31、51、52、53、56)的宫颈刮片样本DNA为模板，建立如下体系：5 μl DNA样本、12.5 μl 2×反应缓冲液(RM)、2 μl FIP (10 pmol/μl)、2 μl BIP (10 pmol/μl)、0.5 μl F3 (10 pmol/μl)、0.5 μl B3(10 pmol/μl)、1 μl Bst DNA聚合酶 (EM)、去离子水(DW)补充至25 μl。混匀后置于LA-320型LAMP Real-time Turbidimeter仪内61℃恒温扩增。见图1，图2。记录扩增曲线图，待反应结束后添加SYBR Green I 5 μl，肉眼观察阳性管内液体颜色荧光情况，检测LAMP方法的特异性。

1.5LAMP检测HPV灵敏度将1.3提取的质粒经紫外分管光度计测定的浓度记录，换算为拷贝数并依次10倍倍比稀释，依次为3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100copies/μl，LAMP检测体系同上。

1.6LAMP与HPV分型试剂盒检测宫颈刮片标本按Qiagen试剂盒说明书提取35份未知宫颈刮片样本DNA，分别进行LAMP和HPV分型试剂盒检测，比较二者结果。

2　结　果

2.1LAMP检测HPV16亚型特异性对12份已知的单重感染12种不同亚型(其中HPV6、11、42、43为低危型，HPV16、18、26、31、51、52、53、56为高危型)的样品DNA进行LAMP扩增，见图1，图2。结果显示：当温度到达61℃时，35 min后仅HPV16亚型为阳性，其他试验样品均为阴性。图3为反应结束后加入5 μl SYBR Green Ⅰ后管内颜色情况，橙黄色为阳性，铁锈色为阴性，可视化结果与图1、图2结果一致。

1: HPV6；2：HPV11；3：HPV42；4：HPV43；5：HPV16；6：HPV18；7：HPV26；8：HPV31图1　HPV6亚型LAMP特异性试验Real-time Turbidimeter分析图

1: HPV51；2：HPV52；3：HPV53；4：HPV56；5：阴性对照图2　HPV16亚型LAMP特异性试验Real-time Turbidimeter分析图

1～13：HPV6、HPV11、 HPV42、 HPV43、 HPV16、 HPV18、 HPV26、 HPV31、 HPV51、 HPV52、 HPV53、 HPV56、阴性对照图3　HPV16亚型LAMP特异性试验可视化图

2.2LAMP检测HPV6型灵敏度结果显示，建立的LAMP体系检测方法最低检测浓度为3×103copies/μl，待反应结束后加入5 μl SYBR Green I后管内颜色情况(图4)与Real-time Turbidimeter仪检测结果一致(图5)，表明该方法有较高敏感性。

1～8：2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2×100 copies/μl图4　HPV16亚型LAMP敏感性试验可视化图

CH1～8：3×107、3×106、3×105、3×104、3×103、3×102、3×101、3×100 copies/μl图5　HPV16亚型LAMP敏感性试验real-time Turbidimeter分析图

2.3LAMP与凯普HPV分型试剂盒检测宫颈刮片标本的结果对比对长春市中心医院提供的35份宫颈刮片临床标本进行LAMP检测和凯普分型试剂盒检测，LAMP方法共检测出10份HPV16亚型感染样本，25份阴性样本，凯普HPV分型试剂盒共检测出10份HPV16亚型感染样本，17份阴性和8份其他HPV亚型感染样本。二者检测结果一致且不存在交叉反应，说明本研究建立的HPV16亚型LAMP检测方法适用于临床检测。

3　讨　论

目前已有100多种HPV亚型被鉴定，其中约40余种与人类生殖器皮肤薪膜病变有关。根据其对生殖系统的致癌性，可将其分为低危型和高危型，前者包括HPV6、11、40、42、43、44、54、61、70、72、81等，以HPV6最为常见，主要引起尖锐湿疣等良性病变；后者包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、72、82等〔6〕，其中以HPV16、18最为常见，常引起恶性病变，如宫颈癌〔7～9〕。由于HPV的致病性与其亚型密切相关，所以对其进行检测和分型对于临床诊断具有重要意义。

本研究基于颜色判定的LAMP技术对HPV16亚型E7基因设计四条特异性引物，利用链置换DNA聚合酶恒温条件下完成扩增，比其他检测方法节省时间且敏感性高。反应中对HPV16亚型进行了检测，通过对其他12种不同亚型的临床样

本进行特异性分析，61℃恒温扩增后仅HPV16为阳性，其他均为阴性，待反应结束后加入SYBR Green I〔10〕后可视化结果与LAMP real-time Turbidimeter LA-320仪结果一致，敏感性试验表明本研究建立的LAMP检测方法最低检出限量为3.0×103copies/μl，具有较强的敏感性，之后对35份未知的宫颈刮片临床样品进行了临床检测，证明了本方法特异性强且无交叉反应。

宫颈癌的前期病变是一个相对较长的时间过程，在诊断后进行干预治疗是预防宫颈癌发生、发展的重要手段，因此宫颈癌的诊治是防癌变的重要内容。本研究着重针对高危型HPV16建立了可视化的LAMP检测方法，利用LAMP real-time Turbidimeter LA-320仪针对HPV反应进程进行实时监控在国内尚属首次，HPV16核酸在61 ℃的恒温条件下反应35 min，即可判定结果，反应结束后在扩增产物中加入了SYBR Green Ⅰ实现了LAMP的可视化，结果更为直观，本方法具有操作简便、敏感性高、成本低廉的特点，为基层医院检测带来方便，为HPV的快速检测提供了一种新的途径。

1崔丽阳，岳天孚.高危型HPV持续感染的影响因素探讨〔J〕.天津医科大学学报，2014;20(3)：209-12.

2Schiffman M，Wentzensen N，Wacholder S，etal.Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer〔J〕.J Natl Cancer Inst，2011;103(5)：368-83.

3段蒙，陈秀杰，曲芃芃.人乳头瘤病毒16型感染及其高危因素分析〔J〕.天津医药，2015;43(4):379-82.

4尧荣凤，赵旭鸿，李智.不同年龄段女性人乳头瘤病毒感染状况分析〔J〕.检验医学，2014;29(7):708-11.

5Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，etal.Loop-mediated is other-mad amplification of DNA〔J〕.Nucleic Acids Res，2000;28(12)：63.

6曲守方，孙彬裕，于婷，等.人乳头瘤病毒核酸(分型)检测试剂(盒)行业标准的验证实验〔J〕.药物分析杂志，2013;33(12)：2039-42.

7赵爱华，张红华.多重人乳头瘤病毒感染与宫颈癌及癌前病变的相关性研究〔J〕.宁夏医学杂志，2009;31：684-6.

8陶萍萍，卞美璐，李敏，等.HPV 多重感染与宫颈病变关系探讨〔J〕.中国妇产科临床杂志，2006;7：94-6.

9王长奇，王康，陈燕萍，等.HPV 多重感染与宫颈病变关系的分析〔J〕.实验与检验医学，2012;30：166-8.

10Iwamoto T，Sonobe T，Hayash IK.Loop-mediated isothermal amplification for direct detection of micro bacterium tuberculosis complex，M.avium，and M.intracellulare in sputum samples〔J〕.J Clin Microbiol，2003;41(6)：2616-22.

〔2015-12-18修回〕

(编辑袁左鸣)

梁迪(1979-)，男，博士，讲师，主要从事生物化学研究。

薛德冬(1978-)，男，主管药师，主要从事临床药学、医院药学方面研究。

R3

A

1005-9202(2016)17-4180-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.020

1吉林大学第二医院药品管理部

2吉林大学第二医院妇产科3吉林大学药学院