白细胞介素-18对分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干扰素-γ和白细胞介素-4表达的影响

曲　莉

(南阳市中心医院耳鼻喉二病区，河南　南阳　473000)



白细胞介素-18对分泌性中耳炎大鼠耳腔灌洗液中干扰素-γ和白细胞介素-4表达的影响

曲莉

(南阳市中心医院耳鼻喉二病区，河南南阳473000)

目的探讨白细胞介素(IL)-18对分泌性中耳炎(OME)大鼠耳腔灌洗液中干扰素(IFN)-γ和IL-4表达的影响。方法选取30只成年雄性SD大鼠，按随机数字表法分为对照组、OME模型组(模型组)和IL-18处理组(观察组)，各10只。参照Hardy的方法对模型、观察组大鼠腹腔注射卵清蛋白(OVA)致敏后耳内激发制成OME模型，对照组大鼠于相同时间点分别腹腔注射氢氧化铝溶液及磷酸盐缓冲液(PBS)。同时观察组于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18溶液(1 μg溶于0.2 ml生理盐水)，对照、模型组同期腹腔注射0.2 ml生理盐水。第18天于耳镜下观察鼓膜像表现，光镜下观察中耳组织的病理学改变，ELISA法测定大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的水平。结果(1)模型、观察组中耳内呈现炎症反应，观察组炎症较模型组有所减轻；(2)三组嗜酸性粒细胞、中性粒细胞及肥大细胞计数比较，模型组三种细胞数均多于对照组，观察组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数多于对照组，中性粒细胞和肥大细胞数多于模型组(P<0.05)，其他两两比较无差异(P>0.05)；(3)模型、观察组大鼠的IFN-γ与IL-4水平均显著高于对照组，且观察组的IFN-γ水平高于模型组(P<0.05)，而模型、观察组IL-4水平无差异(P>0.05)，模型组的Th1/Th2比值显著低于对照、观察组(P<0.05)，对照、观察组无差异(P>0.05)。结论IFN-γ和IL-4共同参与OME的发生发展过程，IL-18可通过上调IFN-γ和IL-4的表达，调控Th1/Th2的平衡状态而抑制OME的进展。

分泌性中耳炎；白细胞介素18；干扰素γ；白细胞介素4

分泌性中耳炎(OME)是中耳非化脓性炎性疾病，病因是咽鼓管的机械性阻塞和功能障碍〔1〕。Th2/Th1细胞失衡是造成OME发生的重要因素〔2〕。白细胞介素(IL)-4和干扰素(IFN)-γ作为Th2和Th1分泌的细胞因子，在OME发生发展中发挥重要作用。IL-18可诱导IFN-γ的产生和T细胞增殖〔3〕，改善OME患者中耳Th2/Th1细胞失衡状态。本研究旨在探讨IL-18对OME的免疫调节机制。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1动物选取30只SPF级成年雄性SD大鼠(购自郑州大学医学院实验中心)，体质量250～300 g，均由耳窥镜检查证实无外耳道及中耳感染。于动物实验室自由进食喂养，室温(21.0±3.0)℃，湿度50%～75%，自然光照，适应性喂养1 w。

1.1.2主要仪器与试剂(1)仪器：酶标仪(美国Thermo)；电子显微镜(日本OLYMPUS)(2)试剂：卵清蛋白(OVA，Ⅴ级，美国Sigma公司)；IL-18(美国R&D公司)ELISA试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)

1.2研究方法

1.2.1动物分组与OME模型制备采用随机数字表法将30只大鼠随机分为对照组、OME模型组和IL-18处理组(观察组)，每组10只。参照Hardy等〔4〕的方法制备OME模型，取1.2 mg OVA溶于0.6 ml磷酸盐缓冲液(PBS)，再取5.14 mg氢氧化铝溶于0.6 ml PBS作为免疫佐剂，震荡均匀，行腹腔注射，第8天行第二次注射，造成全身致敏；于第15天用10%的水合氯醛以15 mg/kg体重的剂量麻醉大鼠，将0.1 mg OVA溶于35 μl PBS中，以微量进样器于手术显微镜下由鼓膜注入，第16天麻醉后观察耳内镜下的鼓膜情况，并注射第2次，形成耳内激发状态，此时OME模型制备完成。模型制备成功表现为鼓膜呈明显内陷、红斑，部分可见液平面及中耳内气泡。对照组大鼠处理方法：取5.14 mg氢氧化铝溶于1.2 ml PBS中，于全身致敏阶段注入腹腔，并于耳内激发阶段注入等量PBS。

1.2.2处理方法〔3〕观察组进行OME造模同时于第1、2、7、8、15、16天腹腔注射IL-18(取1 μg溶于0.2 ml生理盐水)，对照、模型组同期腹腔注射0.2 ml生理盐水。

第18天时麻醉大鼠，于耳镜下观察鼓膜像表现，断头处死，将双侧中耳腔以50 μl PBS液进行3次灌洗，收集150 μl灌洗液，于4℃ 离心机中以4 000 r/min转速离心10 min，将上清液置于-80℃冰箱中保存。取双侧中耳组织固定于4%的多聚甲醛中，脱钙、脱水，行常规石蜡包埋、切片。

1.3观察指标

1.3.1大鼠中耳黏膜组织病理学改变常规苏木素-伊红(HE)染色，于光镜下观察中耳及咽鼓管的病理变化，随机选择细胞数多的5个高倍镜视野，计数嗜酸性粒细胞，甲苯胺蓝染色计数肥大细胞。

1.3.2灌洗液中IFN-γ和IL-4的表达采用ELISA试剂盒测定三组大鼠中耳灌洗液中的IFN-γ和IL-4水平。首先以标准品进行标准曲线的绘制，后采用酶标仪于450 nm波长下测定样品吸光度值，计算其浓度。

1.4统计学方法应用SPSS14.0软件，三组正态分布计量资料行单因素方差分析，两两均数的比较采用SNK-q检验。

2　结　果

2.1耳镜下大鼠鼓膜像的改变对照组鼓膜像大致正常，呈现少量放射状血管纹；模型、观察组大鼠耳膜及周围组织均可见充血，及放射状扩张的血管纹，出现明显内陷及红斑，部分标本可见液平面及气泡，观察组鼓膜镜像较模型组炎症程度有所减轻。

2.2大鼠中耳黏膜组织病理学改变对照组大鼠中耳内组织病理学观察可见，纤毛上皮呈轻度肿胀，纤毛结构正常且排列整齐；模型、观察组耳黏膜明显增厚，毛细血管扩张，纤毛上皮明显肿胀且排列紊乱，部分纤毛脱落，黏膜下层及骨髓腔中可见大量中性粒细胞、嗜酸性粒细胞及淋巴细胞，咽鼓管周围肥大细胞明显增多；观察组炎症表现较模型组有所减轻。模型组三种细胞数均多于对照组，观察组嗜酸性粒细胞和中性粒细胞数多于对照组，中性粒细胞和肥大细胞数多于模型组(P<0.05)，其他两两比较无差异(P>0.05)。见表1。

2.3三组大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表达模型、观察组IFN-γ与IL-4水平均显著高于对照组，且观察组的IFN-γ水平高于模型组(P均<0.05)，而模型、观察组IL-4水平比较无差异(P>0.05)；模型组的Th1/Th2比值显著低于对照、观察组(P<0.05)，而对照、观察组比较无差异(P>0.05)。见表2。

表1　三组大鼠中耳组织切片细胞计数比较±s)

与对照组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05

表2　三组大鼠耳腔灌洗液中IFN-γ和IL-4的表达

3　讨　论

“Th2/Th1失衡假说”认为，正常机体内Th1、Th2细胞及其细胞因子处于动态平衡状态，共同维持机体的免疫自稳，若平衡失调，机体将启动一系列免疫病理反应，产生疾病〔5〕。Th1和Th2为CD4+T辅助细胞在抗原等刺激作用下产生的两种亚群的效应细胞，均来自一个共同的前体细胞Th0，二者在免疫系统中功能各异。其中Th1细胞主要增强吞噬细胞介导的抗感染免疫，其分泌的IFN-γ是巨噬细胞活化必不可少的细胞因子；Th2细胞分泌IL-3、IL-4等大量细胞因子，且诱导B淋巴细胞合成高水平的抗原特异性IgE，主要参与第1型自体免疫疾病，在IgE和嗜酸性粒细胞介导的炎性反应中发挥重要作用〔6〕，两者共同作用与调控维持机体的正常免疫状态。而一旦二者比例失衡，将造成机体的免疫紊乱状态，有研究发现，Th2/Th1失衡与鼻炎、变应性哮喘、宫颈癌等疾病的发生有关〔7～9〕。其与OME的相关关系亦受到学者的广泛关注，刘华等〔3〕研究发现，中耳在各种刺激下可造成Th细胞分化偏移，发生Th2反应，造成粘膜上皮损伤，黏液分泌增加，中耳渗液增加及调节功能下降。因此，如何上调Th1反应及抑制Th2反应成为纠正OME的关键。IL-18为一种由巨噬细胞分泌的多效能的免疫调节因子，有研究表明其对先天性免疫及Th1/Th2免疫反应具有调控作用〔10〕，其对OME的调节作用及相关机制仍待深入探讨。本研究结果表明Th1和Th2细胞参与大鼠OME的发生发展过程，大鼠中耳组织在外源性刺激下，IFN-γ和IL-4表达增多，大量激活Th1和Th2细胞的分泌，介导免疫反应的发生，从而使嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和肥大细胞等免疫细胞增多。与以往研究结果〔3〕相符。此外，IL-18可抑制OME的持续进展，说明其作用机制可能为：IL-18可单独产生或通过与IL-12、IL-2的协同作用诱导产生IFN-γ，上调Th1反应，同时IL-18通过持续激活Th2细胞，维持IL-4的过量分泌，从而发挥Th1/Th2免疫反应的双重调节作用，共同作用使Th1/Th2比值上调，从而调控OME的进展。而另外也有研究指出IL-18可使自然杀伤(NK)细胞的毒性显著增强〔11〕，影响FasL/Fas介导的细胞凋亡，导致OME大鼠的免疫功能紊乱和OME的持续存在，这可能是IL-18对OME的另一种作用机制，对其具体作用方式和调控机制有待深入研究。

1杨琳,赵守琴.分泌性中耳炎发病机制的研究进展〔J〕.听力学及言语疾病杂志,2014;22(3):328-31.

2李贤斌,吴海丽,肖艳林.IL-4和IFN-γ在分泌性中耳炎患者外周血及中耳积液中的表达及意义〔J〕.海南医学院学报,2014;20(12):1604-6.

3刘华,赵守琴,高占梅,等.IL-18对分泌性中耳炎模型大鼠中耳IFN-γ和IL-4表达的影响〔J〕.听力学及言语疾病杂志,2014;22(1):76-80.

4Hardy SM,Heavner SB,White DR,etal.Late-phase allergy and eustachian tube dysfunction〔J〕.Otolaryngol Head Neck Surg,2001;125(4):339-45.

5苗红玲,于海玲,孙美红,等.儿童腺样体肥大程度与分泌性中耳炎发生的相关性研究〔J〕.现代生物医学进展,2014;14(11):2083-7.

6Fukuda K,Nishida T,Fukushima A.Synergistic induction of eotaxin and VCAM-1 expression in human corneal fibroblasts by staphylococcal peptidoglycan and either IL-4 or IL-13〔J〕.Allergol Int,2011;60(3):355-63.

7张仲林,钟玲,袁明勇,等.Th1/Th2/Th17/Treg细胞因子在变应性鼻炎发病中的免疫机制研究〔J〕.医学综述,2014;20(16):2906-9.

8曾雪妮.过敏性哮喘的皮下特异性免疫治疗:CD4+～CD25+～Foxp3+～Treg细胞和Th1/Th2细胞的变化及速发不良反应分析〔D〕.广州：广州医科大学,2014.

9袁芳.Th1/Th2和Th17/Treg平衡失调与宫颈癌发生发展关系及术后CD_4～+淋巴细胞亚群的改变〔D〕.济南：山东大学,2014.

10Zhang L,Hao CQ,Miao L,etal.Role of Th1/Th2 cytokines in serum on the pathogenesis of chronic hepatitis C and the outcome of interferon therapy〔J〕.Genet Mol Res,2014;13(4):9747-55.

11Inoue Y,Abe K,Onozaki K,etal.TGF-β decreases the stability of IL-18-induced IFN-γ mRNA through the expression of TGF-β-induced tristetraprolin in KG-1 cells〔J〕.Biol Pharm Bull,2015;38(4):536-44.

〔2015-12-31修回〕

(编辑袁左鸣)

曲莉(1980-)，女，硕士，主治医师，主要从事耳鼻喉疾病方面的研究。

R76

A

1005-9202(2016)17-4176-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.018