化浊通脉散对下肢动脉硬化闭塞症家兔血小板衍化生长因子-a、-b表达的影响

吴　迪　李慎贤　胡　莹　金钟太　程　磊

(中国医科大学附属盛京医院中医科，辽宁　沈阳　110004)



化浊通脉散对下肢动脉硬化闭塞症家兔血小板衍化生长因子-a、-b表达的影响

吴迪李慎贤胡莹金钟太程磊

(中国医科大学附属盛京医院中医科，辽宁沈阳110004)

目的研究化浊通脉散对下肢动脉硬化闭塞症(ASO)家兔的动脉硬化斑块中血小板衍化生长因子(PDGF)-a、-b表达的影响。方法选纯种新西兰雄性白兔50只，随机分为5组，每组10只：即正常组(A组)、模型组(B组)、化浊通脉散组(C组)、西洛他唑组(D组)、通塞脉片组(E组)，予高脂饮食及股动脉球囊扩张术建立ASO家兔模型，检测药物干预前后家兔血脂的变化，应用实时荧光定量PCR技术测定药物干预后家兔股动脉标本PDGF-a、PDGF-b的相对表达量。结果化浊通脉散能有效地降低血脂如总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，但升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)作用不明显，可以显著降低动脉硬化斑块中细胞间黏附分子(ICAM)-1表达的阳性率(P<0.01)。结论化浊通脉散具有保护动脉血管内膜，抑制动脉粥样硬化形成的作用。

化浊通脉散；动脉粥样硬化；血小板衍化生长因子

下肢动脉硬化闭塞症(ASO)是目前常见病、多发病。随着人群老龄化和饮食结构不合理，ASO发病率逐年上升。西药多从抗凝、溶栓、降脂等方面治疗着手，且对防治慢性病程的ASO尚缺乏满意疗效。当今对于本病治疗的最新方法是干细胞移植，但其安全有效性仍需长期流调学观察。本实验模拟ASO形成过程，以化浊通脉散进行干预，检测实验前后家兔的血脂变化及动脉硬化斑块组织中血小板衍化生长因子(PDGF)-a、-b的表达情况，阐明化浊通脉散治疗ASO的作用靶点。

1　材料与方法

1.1实验动物健康纯种的新西兰雄性白兔50只，10月龄，体重2.8～3.0 kg，由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心提供，许可证号：SCXK(辽)2009-0002。

1.2实验药物化浊通脉散组成：黄芪、金银花、胆星、半夏、茯苓、白术、泽泻、焦山楂、川芎、延胡索、水蛭，由三九药业集团提供，批号：0807021。通塞脉片，由江苏南星药业有限公司提供，批号：120509。西洛他唑片，由浙江大冢制药有限公司提供，批号：120708T。胆固醇：由国药集团化学试剂沈阳有限公司提供，批号：20120120。牛血清白蛋白注射液：由北京奥博星生物技术有限责任公司生产，批号：20120106。

1.3实验试剂与仪器①主要试剂：Triozol Reagent:美国Invitrogen Life technologies公司，引物合成：北京华大基因公司，荧光定量PCR试剂盒：大连宝生生物。血脂系列试剂由我院生化室提供。②主要仪器：德国Eppendorf5417R离心机，雅培ARCHITECTci8200全自动生化免疫分析仪，小型台式离心机(美国SIGMA,1-13)，高速冷冻离心机Sigma 31k5C型，美国PCR扩增仪(德国Biometra)，紫外分光光度计(英国UV-visible Spectrometer,UV300)。

1.4实验方法

1.4.1分组与造模造模前以基础饲料适应性喂养1 w，排除饮食异常者。1 w后随机分为5组，每组10只：即空白组(A组)、模型组(B组)、化浊通脉散组(C组)，西洛他唑组(D组)，通塞脉片组(E组)，分笼饲养。正常组喂养普通饲料，自由饮水。其余4组自实验开始喂高脂饮食，每只每日在正常饲料中加胆固醇1 g、猪油5 g。第3天开始均在10%乌拉坦麻醉下由左侧股动脉插管，4F气囊导管拖拉右侧髂股动脉8次，造成机械性内膜损伤〔1〕。实验第7天B、C、D、E组，按文献经耳缘静脉一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg 造成免疫性内皮损伤〔2〕；A组注射等量生理盐水。

1.4.2药物治疗从21～24周末，各组改为正常饮食，进行药物干预，C组予化浊通脉散按生药7.2 g·kg-1·d-1，用量按70 kg成人用量3.3倍计算；E组予通塞脉片0.75片·kg-1·d-1，按60 kg体重成人每日用量20片计算；D组予西洛他唑片4.5 mg·kg-1·d-1，按60 kg体重成人的人兔体表换算公式计算，均混入饲料中喂养。

1.4.3各实验指标测定及方法血脂测定：各组动物于造模前及治疗后分别取外周静脉血5 ml，均以2 500 r/min离心30 min，以取得血清，2 h内应用雅培全自动生化免疫分析仪分别检测总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，比较各组数值造模前后的变化及各组之间的变化。

1.4.4实时荧光定量PCR检测PDGF-a、PDGF-b mRNA含量实验结束后将动物用乙醚麻醉，解剖切取股动脉血管多段，长约0.2～0.3 cm，放到盛有1 ml Trizol的1.5 ml EP管中保存，制备实验标本，然后处死动物。序列：GAPDH(105 bp)正义链：5' TGCCGCCTGGAGAAAG 3'；反义链：5' GACCTGGTCCTCGGTGTAG 3'；PDGF-a(252 bp)正义链：5' GCTGCGACCTTTGAGACA 3'，反义链：5' GCCCAGACTTGCGGACA 3'； PDGF(144 bp)正义链：5' TGCACCGCAACAAGCAC 3'，反义链：5' TGTAGCCGCCGTCACTCT 3'。操作步骤：参照Trizol说明书采取一步法提取总RNA。采用紫外可见光分光光度计测定260 nm、280 nmOD值，二者比值在1.8～2.0之间，逆转录合成cDNA，反应条件：37℃，15 min，85℃，5 s。应用ABI 7500 扩增仪进行PCR扩增，反应条件：95℃，0.5 min，1个循环，95℃，5 min，60℃，34 s，40个循环，95℃，15 s，60℃，1 min，95℃，15 s，1个循环。通过测定荧光强度而对PCR产物定量。

1.5统计学方法采用SPSS13.0统计学分析软件对数据的组间比较进行单因素方差分析。

2　结　果

2.1血脂系列检测结果造模前各组血脂指标比较无显著差异(P>0.05)。实验结束后，B组、C组、D组、E组与A组相比，TC、TG、LDL-C均升高(P<0.01)；C组、D组、E组与B组相比较TC、TG、LDL-C均较低(P<0.01)，HDL-C较B组升高，但无显著差异(P>0.05)；D组、E组与C组相比较TC、HDL-C无显著差异(P>0.05)，但TG、LDL-C高于C组(P<0.05)。说明化浊通脉散对调控TC、TG、LDL-C有显著效果，见表1。

表1　各组动物血脂指标比较

与A组比较：1)P<0.01；与B组比较：2)P<0.01；与C组比较：3)P<0.05，下表同

2.2RT-PCR检测结果与A组相比，B组、C组、D组、E组的PDGF-a、PDGF-b mRNA表达水平明显升高(P<0.01)，与B组相比，C组、D组、E组的PDGF-a、PDGF-b mRNA表达水平明显下降(P<0.01)，与C组相比，D组、E组的PDGF-a、PDGF-b mRNA表达水平略有升高(P<0.05)。见表2。

表2　各组PDGF-a、PDGF-b mRNA表达比较

3　讨　论

动脉硬化闭塞症属中医“脉痹”、“脱疽〔1，3〕”、“血癖”范畴，在古典文献中多有记载。如《外科理例》中记载了15例“脱疽”病例，就有“…年愈50亦患者，色紫黑，脚痛”。《外科正宗》也提到：“夫脱疽者，外腐而内坏也。描述6例”脱疽中，就有“中年妇女，肥胖，生渴三载，右食指麻痹，月余后发黑”。中医学认为本病与饮食失节、脏腑亏虚、经脉痹阻等有密切关系。饮食失节，膏粱厚味，损伤脾胃，湿浊内生，痰癖互结，阻塞经脉；或因年老体衰，气血亏虚，运行无力，脉络癖阻，气虚血癖，经脉痹阻，气血不达四末而发为“脉痹”；或因肝肾亏虚，气竭精伤，肾水消灼，筋练骨枯，而成“脱疽”之症。总之在ASO形成的病机中，脾失健运，痰湿脂浊壅积，阻滞经脉是其本，气血淤滞不通，肢体失荣是其标。本研究提出“痰、瘀、毒”互结病机新说。因饮食失节、脏腑亏虚、经脉痹阻，致痰、湿、瘀久蕴成毒，脾虚是发病基础，痰、瘀、毒为主要病理因素。我们遵循“治病务求其本”的原则，以“祛痰化瘀通络、健脾解毒化湿”为治疗大法，在补阳还五汤的基础上加减化裁成化浊通脉散(黄芪、川芎、水蛭、金银花、胆南星、半夏、茯苓、白术、泽泻、焦山楂、延胡索)。此方从中医角度加强了古方的活血化瘀、化浊通脉作用；从西医方面加强了古方抗凝血、抗血栓形成、降脂及抑制血管内壁动脉硬化板块形成的作用。重用黄芪：补气，使气旺则血行，瘀消而不伤正，为君药。川芎、水蛭：活血祛瘀，为臣药。胆南星、半夏：祛痰泄浊通络 泽泻：利水渗湿 焦山楂：消痰化瘀 金银花：清热解毒 延胡索：行气止痛，行血中之气，又能行气中之血；共为佐药。全方共同组成益气化瘀通络、健脾祛痰化浊之功。

高脂血症作为动脉粥样硬化(AS)的一种危险因素〔1〕，已被大家确认，本实验也证实了这点。TC、TG、LDL-C过高都是AS的危险因子，LDL-C是致动脉粥样硬化的基本因素。LDL-C通过血管内皮进入血管壁内,在内皮下滞留的LDL-C被修饰成氧化型LDL(ox-LDL),ox-LDL-C不能被正常LDL-C受体识别，而被巨噬细胞的清道夫受体识别而快速摄取，巨噬细胞吞噬ox-LDL后形成泡沫细胞,后者不断地增多、融合,构成了动脉粥样硬化斑块的脂质核心。ox-LDL可刺激机体产生大量的黏附分子、化学趋化分子、细胞因子、生长因子和细胞毒素等，进一步促进了动脉粥样硬化的发生、发展〔2〕。而HDL-C因为它能移除外周组织的胆固醇，转运给肝脏进行分解代谢。HDL-C还可能通过抗炎、抗氧化和保护血管内皮功能而发挥其抗动脉粥样硬化作用。被认为有防治动脉粥样硬化发生、发展的作用。本实验研究证明化浊通脉散虽对HDL-C作用不明显，但对TG、LDL-C有较明显的抑制作用，亦减轻了以上LDL-C促动脉粥样硬化的作用，说明化浊通脉散可通过减低血脂来抑制动脉粥样硬化形成和发展。

在动脉硬化发生过程中，损伤的内皮细胞分泌生长因子，PDGF与其受体结合能促进大量单核细胞聚集、黏附、增殖及向内膜下迁移，形成单核细胞源性泡沫细胞〔4〕。内皮细胞分泌的PDGF，可以启动动脉中膜平滑肌细胞(SMC)经内弹力膜的窗孔迁入内膜，发生增生、转化、分泌细胞因子以及合成细胞外基质。SMC经其表面的受体介导而吞噬脂质，形成SMC源性泡沫细胞。可见PDGF在动脉硬化斑块的发生、发展中起到关键作用。本实验提示此方通过降低PDGF-a、PDGF-b抑制AS发生、发展。

1徐建,郝文君,白小涓,等.阿托伐他汀对兔动脉粥样硬化的影响〔J〕.中国老年学杂志,2006;26(11):1550-1.

2隋萍,殷禄昌,刘晓红.2型糖尿病患者合并下肢动脉硬化闭塞症相关危险因素分析〔J〕.中国当代医药,2010;19(3):7-9.

3张凡帆,庞鹤.动脉硬化闭塞症中医证候要素文献分布研究〔J〕.北京中医药,2012;31(3)：172-4.

4李旭,邵明哲,范隆华.血小板衍化生长因子及其受体在糖尿病下肢动脉硬化闭塞症中的表达及意义〔J〕.复旦学报(医学版),2011;38(40):303-9.

〔2015-04-11修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

辽宁省科技厅项目(201122520)

李慎贤(1952-)，女，教授，主任医师，硕士生导师，主要从事周围血管病研究。

吴迪(1985-)，女，医师，硕士，主要从事周围血管病研究。

R543.5

A

1005-9202(2016)17-4161-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.011