声敏剂5-氨基乙酰丙酸对器官组织及血液生化学指标的影响

王丽平　张振环　李茜楠　贾智博　孙　鑫　林　琳

(哈尔滨医科大学,黑龙江　哈尔滨　150086)



声敏剂5-氨基乙酰丙酸对器官组织及血液生化学指标的影响

王丽平张振环李茜楠贾智博孙鑫林琳

(哈尔滨医科大学,黑龙江哈尔滨150086)

目的探讨声敏剂5-氨基乙酰丙酸(ALA)对器官组织及血液生化学指标的影响。方法50只Wistar大鼠随机分为5组，每组10只，A组按照30 mg/kg剂量给予股静脉注射ALA溶液，B、C组按照60、120 mg/kg静脉注射ALA溶液，D组静脉注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，以2 W/cm2超声强度超声照射大鼠股动脉15 min，对照组股静脉注射磷酸盐缓冲液(PBS)1 ml。用药后7 d各组大鼠采用腹腔注射超量戊巴比妥钠的方法处死，取下腔静脉血2 ml进行血生化检测。取甲状腺、胸腺、肾上腺、脑、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏进行病理学检测。结果用药后大鼠均自由活动，一般状况可，毛色光泽，进食和排便正常，7 d内无死亡。用药后7 d用药组和对照组大鼠甲状腺、胸腺、肾上腺、脑、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏组织切片光镜下观察均未发现有病理性改变；用药后7 d各组大鼠血清总蛋白(TP)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和血糖(BS)测定结果均基本在正常参考范围内，且各组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论大鼠应用声敏剂ALA未引起重要脏器组织改变和血液生化各指标异常，可安全的用于声动力治疗(SDT)动脉粥样硬化研究。

5-氨基乙酰丙酸；声动力治疗；动脉粥样硬化

声动力疗法(SDT)是一种新出现的治疗新生物或者非新生物疾病的方法，是通过超声和声敏剂的协同作用，对人体组织产生破坏作用，这种作用在医学上可用于治疗疾病，现已证明可对肿瘤细胞产生较强的杀伤作用，广泛应用于肿瘤的治疗〔1〕。动脉粥样硬化(AS)斑块对声敏剂也有特异性的吸收作用。课题组前期工作已发现，在兔颈动脉AS模型中，使用5-氨基乙酰丙酸(ALA)为声敏剂的SDT能明显减小AS斑块并使斑块趋于稳定〔2〕。本实验采用大鼠静脉注射ALA并加上超声照射方法，观察ALA为声敏剂的SDT的安全性。

1　材料与方法

1.1动物、药品及仪器健康雄性Wistar大鼠50只，10周龄左右，体重200～250 g，购于哈尔滨医科大学附属第二医院动物实验中心。ALA购于Sigma公司，3%戊巴比妥钠及利多卡因购于上海索莱宝生物科技有限公司，脉冲超声治疗仪购于深圳圣祥高科技有限公司，Olympus IX70显微镜购于日本Olympus公司，低温高速离心机购于德国Biofuge公司，全自动生化分析仪Type AU2700购于日本Olympus公司。

1.2试剂及准备磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mol/L)的配制：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.22 g，双蒸水定容至1 L，细菌滤器过滤，4℃冰箱保存备用。ALA的配制：在避光条件下，将2.5 g ALA溶于100 ml PBS 溶液中，配制成25 mg/ml浓度备用，现用现配，避光保存。

1.3实验方法50只大鼠随机分为5组，每组10只，即A组、B组、C组、D组和对照组。A组按照30 mg/kg剂量给予股静脉注射ALA溶液，B、C组按照60、120 mg/kg静脉注射ALA溶液，D组静脉注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，以2 W/cm2超声强度超声照射大鼠股动脉区域15 min，对照组股静脉注射PBS 1 ml。具体方法：以3%戊巴比妥钠(0.14 ml/100 g)腹腔注射麻醉后，A、B组和C组大鼠仰卧固定于手术台上，左侧腹股沟区备皮，碘伏消毒，在腹股沟正中剪开皮肤约1 cm，分离脂肪，暴露股动脉和股静脉，避光条件下直接向股静脉内注药，拔针后无菌纱布按压止血，缝合伤口，5%利多卡因纱布敷于伤口周围的皮肤，保温，避光2 h，苏醒后正常饲养。D组大鼠上述方法股静脉注射ALA 120 mg/kg，避光2 h后，将兔仰卧位固定于手术台上，右侧腹股沟区备皮，将装有冷氯化钠溶液的自制水袋(4℃)置于兔腹股沟区股动脉搏动处，采用超声输出强度2 W/cm2进行照射，照射时间为15 min，超声主要指标设定为：探头传感器0.87 MHz，直径34 mm。对照组上述方法股静脉注射PBS 1 ml，避光2 h，苏醒后给予正常饲料喂养。用药后7 d各组大鼠禁食12 h禁水6 h，采用腹腔注射超量戊巴比妥钠(100 mg/kg)的方法处死动物，取各组大鼠下腔静脉血2 ml进行血生化检测。取甲状腺、胸腺、肾上腺、脑、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏进行病理学检测。

1.4指标检测

1.4.1组织病理学分析各组动物脏器组织4%中性甲醛溶液固定，脱水，石蜡包埋，进行连续性病理切片，常规HE染色，光镜下观察有无病理性改变。

1.4.2血清生化水平测定各组大鼠静脉血2 ml，3 000 r/min离心5 min，分离血清，全自动生化分析仪测定血清总蛋白(TP)、谷氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)和血糖(BG)。

1.5统计学方法应用SPSS13.0统计学分析软件对数据的组间比较进行t检验。

2　结　果

2.1一般情况用药后大鼠均自由活动，一般状况可，毛色光泽，进食和排便正常，7 d内无死亡。

2.2脏器组织学观察用药后7 d用药组和对照组各组大鼠甲状腺、胸腺、肾上腺、脑、肺脏、心脏、肝脏、肾脏、脾脏组织切片光镜下观察均未发现有病理性改变。

2.3血液生化指标测定用药后7 d各组大鼠血清TP、ALT、AST、BUN、Cr和BS测定结果均基本在正常参考范围内，且各组与对照组比较差异无显著性(P>0.05)。见表1。

表1　用药后7 d各组大鼠血清生化指标测定值±s)

3　讨　论

AS是脂质、碳水化合物、血液成分的灶状沉积〔3〕，结缔组织和钙沉积所致的伴有动脉中层改变的联合病变，它主要累及大中型肌弹力型动脉，以主动脉、冠状动脉及脑动脉为多见，常导致慢性管腔闭塞或急性斑块破裂诱发血栓形成和管壁破裂出血等严重后果，是危害人类健康最严重的心血管疾病〔4〕。目前AS的治疗方式除了降低危险因素外，主要就是经皮介入治疗和药物涂层支架的使用，调脂治疗以及抗血小板治疗。非药物治疗主要包括经皮冠状动脉介入治疗(PCI)、动脉内膜切除术以及冠状动脉旁路移植术(CABG)等。虽然这些技术一定程度上改善了患者的生活质量和预后，但是机械创伤大，并且出现了术后再狭窄(10%～20%)〔5，6〕及增加了支架内血栓的发生率(0.6%～3.1%)。另外对于血管弥漫性病变和分叉病变等效果较差。

SDT是一种新出现的治疗新生物或者非新生物疾病的方法，是通过超声和声敏剂的协同作用，对人体组织产生破坏作用，这种作用在医学上可用于治疗疾病，现已证明可对肿瘤细胞产生较强的杀伤作用，广泛应用于肿瘤的治疗〔1〕。SDT充分利用声波选择性作用于病灶和声敏剂选择性蓄积的双重选择作用特异地杀伤细胞，对健康组织损害小、毒副反应少〔7〕。最早的声敏剂是应用血卟啉或卟啉类衍生物等光敏剂，进一步研究中发现一些非卟啉类的化合物也有声敏作用，如非甾体类抗炎药、曙红B、玫瑰红等也有声敏作用。声敏剂 ALA是第二代光敏剂，与其他光敏剂相比，具有副作用小，用药后避光时间短，渗透性好，对组织深层病变的疗效和选择性更佳等优点，成为目前光动力治疗领域研究的方向和热点〔8〕。ALA是一简单的五碳化合物，多以盐酸盐形式存在，分子式为C5H9NO3·HCl。它是生物体的内源性物质，是动物血红素和植物叶绿素生物合成的前体物质，在体内转变为原卟啉Ⅸ(PpⅨ)在体内24 h 内被清除〔9〕。PpⅨ是血红素内源性合成代谢途径中的一种前体。PpⅨ是一种非常有效的光敏剂，它在一定波长的光照射下，发生化学反应，产生单重态氧和氧化物，引起细胞膜、线粒体和核酸的损伤，使病变细胞坏死、凋亡，从而起到治疗疾病的作用〔10〕。现在研究发现，PpIX也具有声敏剂的特性。目前亦开始用于声动力治疗。

声敏剂常静脉注射，也可局部给药。新生物组织对声敏剂优势摄取，并较长时间滞留其内〔11〕。声敏剂被动脉粥样斑块选择性摄取的机制可能为：其与血清白蛋白和脂蛋白尤其是低密度脂蛋白相结合，由于AS斑块中含有大量巨噬细胞、平滑肌细胞，有大量的低密度脂蛋白受体，因此，声敏剂通过低密度脂蛋白受体介导可较多聚集在斑块的细胞内〔12〕。

由于SDT 具有相对小的毒副作用，且具有无创的优点，SDT 一经提出立刻受到全世界学者的高度重视。Umemura等〔13〕通过生物体内和体外的实验研究表明，在血卟啉存在条件下，超声与血卟啉共同作用诱导肿瘤细胞坏死比无血卟啉时明显增多，由此提出了声动力治疗的概念。Koh等〔14〕研究了声动力治疗用于兔股动脉置入支架后再狭窄预防作用，本课题组前期工作中，我们发现在兔模型中，声敏剂ALA 为60 mg/kg浓度时SDT通过诱导巨噬细胞凋亡，减少脂质积聚和增加血管平滑肌细胞以及胶原的含量发挥了减轻AS和稳定斑块的作用〔2〕。本研究结果说明ALA 120 mg/kg给药结合超声照射的实验方法也是安全的。以ALA为声敏剂的声动力治疗是安全的，为下一步声动力治疗AS研究提供了有效保障。

1Shibaguchi H，Tsuru H，Kuroki M，etal.Sonodynamic cancer therapy：a non-invasive and repeatable approach using low-intensity ultrasound with a sonosensitizer〔J〕.Anticancer Res，2011；31(7)：2425-9.

2Peng CH，Li YS，Liang HJ，etal.Detection and photodynamic therapy of inflamed atherosclerotic plaques in the carotid artery of rabbits〔J〕.J Photochem Photobiol B，2011；102(1)：26-31.

3Tabas I.Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis〔J〕.Nat Rev Immunol，2010；10(1)：36-46.

4Xu JQ，Song YB，Hahn JY，etal.Pattern of instent neointimal formation compared to native atherosclerosis in the coronary bifurcation lesions：volumetric intravascular ultrasound analysis〔J〕.Chin Med J(Engl),2013；126(18)：3505-10.

5Mieres J，Rodriguez AE.Stent selection in patients with myocardial infarction：drug eluting，biodegradable polymers or bare metal stents〔J〕?Recent Pat Cardiovasc Drug Discov，2012；7(2)：105-20.

6杨蕾，王丽娟.冠状动脉支架内再狭窄的相关性因素分析〔J〕.中国动脉硬化杂志，2013；21(5)：449-53.

7Wang X，Liu Q，Wang Z，etal.Role of autophagy in sonodynamic therapy-induced cytotoxicity in S180 cells〔J〕.Ultrasound Med Biol，2010；36(11)：1933-46.

8Nokes B，Apel M，Jones C，etal.Aminolevulinic acid (ALA)：photodynamic detection and potential therapeutic applications〔J〕.J Surg Res，2013；181(2)：262-71.

9Colditz MJ，Jeffree RL.Aminolevulinic acid (ALA)-protoporphyrin Ⅸ fluorescence guided tumour resection.Part 1：Clinical，radiological and pathological studies〔J〕.J Clin Neurosci，2012；19(11)：1471-4.

10Rahman MM，Ninomiya K，Ogino C，etal.Ultrasound-induced membrane lipid peroxidation and cell damage of Escherichia coli in the presence of non-woven TiO2 fabrics〔J〕.Ultrason Sonochem，2010；17(4)：738-43.

11Schweiger ES，Riddle CC，Aires DJ.Treatment of hidradenitis suppurativa by photodynamic therapy withaminolevulinic acid：preliminary results〔J〕.J Drugs Dermatol，2011；10(4)：381-6.

12Silva JN，Filipe P，Morlière P，etal.Photodynamic therapies：principles and present medical applications〔J〕.Biomed Mater Eng，2006；16(4 Suppl)：S147-54.

13Umemura S，Yumita N，Nishigaki R，etal.Sonochemical activation of hematoporphyrin：a potential modility for cancer treatment〔C〕.Proc of 1989 IEEE Ultrasonic Symp，1989：955-60.

14Koh A，Kousukue H，Hiroyuki K，etal.Sonodynamic therapy decreased neointimal hyperplasia after stenting in the rabbit iliac artery〔J〕.Circulation，2002；105：149-51.

〔2015-03-17修回〕

(编辑苑云杰/曹梦园)

黑龙江省卫生厅科研资助项目(2010-073)

贾智博(1975-)，男，副主任医师，博士，主要从事心肌梗死后细胞移植研究。

王丽平(1976-)，女，副主任医师，博士，主要从事冠心病防治研究。

R543.5

A

1005-9202(2016)17-4155-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.008