川芎嗪抗β淀粉样蛋白25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用的机制

尹淑杰　柳朝阳　任永波　宋庆娇　张　涛

(佳木斯大学，黑龙江　佳木斯　154007)



川芎嗪抗β淀粉样蛋白25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用的机制

尹淑杰1柳朝阳2任永波宋庆娇张涛

(佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007)

目的探讨川芎嗪是否作用PI3K/Akt通路抗β淀粉样蛋白(Aβ)25～35诱导的细胞凋亡。方法Aβ25～35作用SH-SY5Y细胞建立AD细胞模型，MTT法检测细胞的生存率，流式细胞术检测细胞凋亡率；Western印迹检测p-Akt、Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表达。结果川芎嗪能够抑制Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡和促进其存活；川芎嗪可抑制Aβ25～35引起的p-Akt/Akt、Bcl-2表达降低和Bax、caspase-3的表达增加。PI3K/Akt通路抑制剂LY294002能够抑制川芎嗪对Aβ25～35诱导的细胞凋亡的保护作用，抑制川芎嗪诱导的p-Akt/Akt、Bcl-2表达上调及Bax、caspase-3表达下调。结论川芎嗪拮抗Aβ25～35诱导的细胞凋亡与作用PI3K/Akt通路，调节Bcl-2、Bax、caspase-3的表达有关。

川芎嗪；细胞凋亡；阿尔茨海默病；PI3K/Akt信号通路

川芎嗪(TMP)是中药川芎根茎中的生物碱单体，具有抗凝、抑制血小板聚集、扩张血管、改善微循环等广泛的生物作用。临床上主要用于治疗多种心血管疾病〔1，2〕。本实验探讨TMP抗β淀粉样蛋白(Aβ)25～35诱导的神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡是否与作用于PI3K/Akt通路有关。

1　材料与方法

1.1材料SH-SY5Y细胞株购于中国医学科学院肿瘤研究所细胞库。 TMP纯品、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)抑制剂LY294002、Aβ25～35购于Sigma公司；膜联蛋白A5-绿色荧光素(Annexin V-FITC)细胞凋亡检测试剂盒、Akt、p-Akt、Bax、Bcl-2、caspase-3抗体、β-actin等抗体购于北京中杉金桥生物公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养SH-SY5Y细胞置于培养箱(37℃、5% CO2)，每2～3 d传代1 次。取对数生长期的细胞进行药物作用和检测指标。

1.2.2阿尔茨海默病(AD)细胞模型的制备取对数生长期浓度为1×105/ml SH-SY5Y细胞2 ml接种于6孔板，培养24 h。24 h后加入Aβ25～35继续培养24 h后收集细胞。

实验分对照组、Aβ25～35组、TMP组(1 mmol/L)、LY组(LY294002浓度为50 μmol/L)、TMP+LY组。除对照组外，其余下四组Aβ25～35的浓度均为20 μmol/L。

1.2.3MTT法检测细胞生存率胰酶消化对数生长期的细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml，接种于96孔培养板，每孔100 μl，培养24 h，加入Aβ25～35及TMP，对照组加入等量的培养基，继续培养24 h，同时设空白对照(单纯培养基、无细胞)组。加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl；培养4 h，每孔加入200 μl二甲基亚砜(DMSO)，于490 nm处检测吸光度(OD)值。计算细胞存活率=(实验组OD值-空白对照组OD值)/(对照组OD值-空白对照组OD值)。

1.2.4Annexin V-Fluos染色检测细胞凋亡各组细胞胰酶消化，成悬液吹打，离心调节细胞浓度至1×105/ml，加入AimexinV-Fluos约100 μl/管，15℃避光15 min，用流式细胞仪检测调亡(Ex=488 nm；Em=515 mn)，利用FCSExpress 3.0软件分析细胞凋亡。

1.2.5Western印迹法检测Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达收集各组细胞提取总蛋白，测定各组蛋白质含量。各组取等量蛋白上样，用10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)进行凝胶电泳，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF) 膜上。5%脱脂牛奶在4℃封闭 1 h，分别加入用封闭液稀释的一抗Akt (1∶500)、p-Akt(1∶500)、Bcl-2(1∶500)、Bax (1∶500)、caspase-3 (1∶500)，β-actin(1∶2 000)，4℃孵育过夜，加入羊抗兔或抗鼠的第二抗体(1∶2 000)，室温杂交1 h，采用增强化学发光法(ECL)检测分析结果。对蛋白条带灰度进行分析，以β-actin的灰度值为对照，计算各组蛋白相对表达水平。

1.3统计学方法应用SPSS11.0软件行LSD检验或单因素方差分析。

2　结　果

2.1TMP作用PI3K/Akt通路促进SH-SY5Y细胞存活SH-SY5Y细胞存活率：对照组〔(100.0±3.91)%〕高于Aβ25～35组〔(69.5±4.34)%〕(P<0.05 )；TMP组〔(92.8±2.32)%〕高于Aβ25～35组(P<0.05)；TMP+LY 组细胞存活率〔(81.5±2.09)%〕高于Aβ25～35组(P<0.05)低于TMP 组(P<0.05)，LY组〔(54.7±3.31)%〕低于Aβ25～35组和TMP+LY 组(P<0.05)。表明LY294002可以抑制TMP 促进Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞存活的作用。

2.2TMP作用PI3K/Akt通路拮抗Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡SH-SY5Y细胞凋亡率检测结果，LY组〔(52.1±3.76)%〕最高，对照组〔(4.1±0.03)%〕最低；TMP+LY组〔(31.5±3.11)%〕高于TMP组〔(7.3±0.17)%〕和Aβ25～35组〔(16.3±1.39)%〕(P<0.05)；TMP 组低于Aβ25～35组和TMP+LY组(P<0.05)。说明TMP能够拮抗Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡，抑制PI3K/Akt通路可以抑制TMP拮抗Aβ25～35诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用。

2.3TMP对Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax、caspase-3表达的影响p-Akt/Akt 比值和Bcl-2表达：与Aβ25～35组相比，对照组最高(P<0.05)，LY组最低(P<0.05)，TMP组较高(P<0.05)；与TMP组相比，TMP+LY 组较低(P<0.05)；而TMP+LY组高于LY组(P<0.05)，表明TMP能够促进p-Akt和Bcl-2的表达，PI3K/Akt抑制剂-LY294002能部分抑制TMP对p-Akt和Bcl-2表达的影响。Bax和caspase-3表达：与Aβ25～35组相比，TMP 组表达较低(P<0.05)；与TMP组相比，TMP+LY组表达较高(P<0.05)：而TMP+LY组的表达低于LY组和Aβ25～35组(P<0.05)。 说明TMP 能够抑制Bax和caspase-3表达，P13K/Akt 抑制剂-LY294002 能够部分抑制TMP对Bax和caspase-3表达的影响。见表1。

表1　Western印迹检测 p-Akt/Akt、 Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表达

与Aβ25～35组相比：1)P<0.05；与TMP组相比：2)P<0.05；与LY组相比：3)P<0.05

3　讨　论

AD是一种神经退行性疾病，以进行性认知功能障碍为主要临床表现。Aβ形成的老年斑和神经元纤维缠结〔3〕及因细胞凋亡而导致广泛的神经元和突触的丢失是AD病理特征。研究发现，AD患者脑中存在大量的神经元凋亡和异常表达的凋亡相关蛋白酶〔4〕。

PI3K/Akt是在细胞生长增殖和代谢等方面发挥重要作用的信号通路〔5〕，与肿瘤、代谢疾病和神经退行性疾病等均有关〔6〕。PI3K/Akt抑制细胞凋亡，一方面通过抑制Bcl-2家族蛋白和caspase蛋白实现，另一方面通过促进细胞存活的基因表达实现〔7〕。PI3K/Akt与AD密切相关。有研究发现，AD患者脑中Akt的活性和含量明显降低；Aβ25～35下调Akt的表达抑制激活PI3K/Akt信号通路〔8〕。Aβ25～35能通过抑制激活PI3K/Akt通路而诱导细胞凋亡〔9〕。因此，通过激活PI3K/Akt信号通路可以抑制神经元凋亡。由此可见，在AD的发病机制中，信号通路PI3K/Akt具有重要作用，也是治疗AD的有效靶点。

如果TMP可以激活信号通路PI3K/Akt来抑制 由Aβ25～35诱导的细胞凋亡，那么PI3K/Akt通路抑制剂就可以抑制TMP的抗 Aβ25～35诱导的细胞凋亡。本实验结果表明TMP可以诱导Akt磷酸化，这个作用可被LY294002抑制，TMP具有激活PI3K/Akt信号通路作用。抗细胞凋亡通路PI3K/Akt具有调节Bcl-2、Bax、 caspase-3等表达的作用。我们推断TMP主要作用PI3K/Akt通路上调Bcl-2的表达、下调caspase-3、Bax促凋亡蛋白的表达，抗Aβ25～35引起的细胞凋亡。因此抑制TMP抗Aβ25～35诱导的细胞凋亡可以通过抑制PI3K/Akt通路的激活实现。抑制信号通路PI3K/Akt可抑制TMP拮抗Aβ25～35诱导的细胞凋亡。

1李金柱，李伟.川芎嗪的结构改造及其生物活性研究进展〔J〕.中国实用医药，2008；3(1)：137-8.

2姜宏，施广飞，朱珠.川芎嗪对心血管作用研究进展〔J〕.中国临床药理学与治疗学，2007；12(5)：484-6.

3Ballard C，Gauthier S，Corbett A，etal.Alzheimer's disease〔J〕.Lancet，2011；377(9770)：1019-31.

4Serrano-Pozo A，Frosch MP，Masliah E，etal.Neuropathological alterations in Alzheimer disease〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Med，2011；1(1)：a006189.

5Vadas O，Burke JE，Zhang X，etal.Structural basis for activation and inhibition of class I phosphoinositide 3-kinases〔J〕.Sci Signal，2011；4(195)：e2.

6Hemmings BA，Restuccia DF.PI3K-PKB/Akt pathway〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol，2012；4(9)：11189.

7Duronio V.The life of a cell；apoptosis regulation by the PI3K/PK Bpathway〔J〕.Biochem J，2008；415(3)：333-44.

8Lee HK，Kumar P，Fu Q，etal.The insulin/Akt signaling pathway is targeted by intracellular beta-amyloid〔J〕.Mol Biol Cell，2009；20(5)：1533-44.

9Martin D，Salinas M，Lopez-Valdaliso R，etal.Effect of the Alzheimer amyloid fragment Abeta(25-35) on Akt/PKB kinase and survival of PC 12 cells〔J〕.J Neurochem，2001；78(5)：1000-8.

〔2015-12-09修回〕

(编辑袁左鸣)

黑龙江省普通高等学校青年学术骨干支持计划项目(1252G059);黑龙江省自然科学基金资助项目(H2015074);佳木斯大学科技重点项目(Sz2011-009);黑龙江省大学生创新创业训练项目(20050222026)

张涛(1971-)，女，博士，教授，硕士导师，主要从事中草药抗肿瘤及肿瘤免疫机制方面的研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任医师，主要从事脑血管病、癫痫，头痛眩晕及老年痴呆的诊断和治疗。

R2-031

A

1005-9202(2016)17-4151-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.006

1济宁市第二人民医院神经内科

2佳木斯大学附属第一医院神经四科