利拉鲁肽对大鼠压力负荷型慢性心衰的保护作用

王晨阳, 曹海涛*，张志华，华川

(1.解放军第252医院动物实验室，河北 保定　071000； 2.解放军第252医院内分泌科，河北 保定　071000；3.解放军第252医院检验科，河北 保定　071000)



利拉鲁肽对大鼠压力负荷型慢性心衰的保护作用

王晨阳1, 曹海涛1*，张志华2，华川3

(1.解放军第252医院动物实验室，河北 保定071000； 2.解放军第252医院内分泌科，河北 保定071000；3.解放军第252医院检验科，河北 保定071000)

目的 研究利拉鲁肽对压力负荷型慢性心衰大鼠心脏功能的作用及其机制。方法30只SD大鼠随机分成假手术组、心衰组、利拉鲁肽组，每组10只大鼠。心衰组、利拉鲁肽组采用腹主动脉缩窄法制备模型，假手术组只穿线不缩窄。利拉鲁肽组术后12周给予利拉鲁肽皮下注射，2 mg/kg·d，共30 d。假手术组和心衰组给予同等剂量的生理盐水。给药30 d后给大鼠称重，并使用压力容积系统来检测血流动力学指标，同时对大鼠的各个器官称重。将大鼠麻醉后，腹主动脉抽血离心后取血清，按试剂盒方法测定超氧化物歧化酶(SOD)、B型钠尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)。结果心脏称重显示，利拉鲁肽组的心脏重量明显低于心衰组(P< 0.05)。压力容积系统检测血流动力学显示，相比于假手术组，利拉鲁肽组大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明显降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值则明显增加(P< 0.05)。和心衰组相比，利拉鲁肽组大鼠血清中的SOD值明显增加(P< 0.05)，BNP值则明显降低(P< 0.05)。结论利拉鲁肽可以改善心衰大鼠左心室的收缩和舒张功能，减轻心肌细胞的损伤，其机制可能与抗氧化作用相关。

利拉鲁肽；压力超负荷；心力衰竭

近年来，利拉鲁肽作为一种人胰升糖素样肽1(GLP-1)类似物受到广泛关注，由于其良好的降血糖作用，被广泛的应用于2型糖尿病患者。大量研究表明，利拉鲁肽不仅具有葡萄糖依赖性降糖作用[1]，同时对心血管系统具有直接或间接的保护作用，并且这种作用独立于血糖调节机制[2]。它具有降低血脂、血压[3]，调节血管内皮细胞代谢，预防动脉粥样硬化[4]，减少心肌细胞损伤，改善心功能[5]等功效。

大量基础与临床研究显示利拉鲁肽对2型糖尿病患者心血管系统具有良好的预防和改善作用，但是利拉鲁肽对于不合并糖尿病的压力负荷型慢性心衰的作用及机制研究未见报道。压力负荷型慢性心衰主要是由于压力负荷产生高血压，进而导致心脏左室肥厚、重构，心脏泵血功能降低，逐步发生心力衰竭，最终导致心血管病的高死亡率。本研究通过建立压力负荷型慢性心衰大鼠模型，观察GLP-1类似物利拉鲁肽对慢性心衰大鼠的左心室功能、血清酶的影响，并探讨其可能的机制。

1　材料和方法

1.1实验动物

SPF级SD雄性大鼠30只，8周，体重160～180 g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供[SCXK(京)2012-0004]。无菌手术在解放军第252医院动物实验室[SYXK(军)2007-019]进行，并按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2主要试剂与仪器

利拉鲁肽(预填充注射笔)由诺和诺德(中国)制药有限公司提供；超氧化物歧化酶(SOD)、B型钠尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)试剂盒均来自R&D公司；日立7600-020全自动生化分析仪(日立公司)； MPVS Ultra-400压力-容积系统(AD Instrumengts公司)，导管型号为SPR-838，采用PowerLab(AD Instrumengts公司)进行数据采集和分析。

1.3实验方法

1.3.1动物分组及给药

30只大鼠随机分为3组：假手术组10只；心衰组10只；利拉鲁肽组10只。心衰组和利拉鲁肽组采用腹主动脉缩窄术制备压力超负荷心衰大鼠模型。假手术组只行腹主动脉穿线不缩窄。利拉鲁肽组术后12周给予利拉鲁肽皮下注射，2 mg/kg·d。共30 d。假手术组和心衰组给予同等剂量生理盐水，共30 d。在手术过程中，假手术组死亡1只，心衰组死亡1只，利拉鲁肽组死亡1只，在术后第2周心衰组死亡一只。最后假手术组9只大鼠，心衰组8只大鼠和利拉鲁肽组9只大鼠进入实验。

1.3.2心衰动物模型的建立

参照Conrad等[6]的方法并作改进[7,8]。大鼠适应性喂养10 d，术前12 h禁食，自由饮水。称重后，用50 mg/kg的戊巴比妥钠腹腔内注射麻醉，麻醉成功后，在左侧脊肋角区大概2 cm2的范围备皮，1%碘伏消毒，纵向切开皮肤，钝性分离肌肉，暴露腹主动脉，剥离腹主动脉周围的结缔组织，跟据腹主动脉粗细以直径为0.8 mm左右的不锈钢探针(或使用小鼠灌胃针，去掉圆头)与腹主动脉一起使用4号手术线结扎，双线结扎，抽出探针形成腹主动脉狭窄(约50%～60%)，缝合肌层和手术切口，同时腹腔注射青霉素10万IU。假手术组腹主动脉只穿线而不进行缩窄，其他手术步骤同模型组。

1.3.3心、肺/体重比的计算

麻醉后立即开胸取出心脏、肺脏，在预冷的0～4℃生理盐水中洗去淤血，滤纸吸干水分，应用精密天平测定各组动物的心脏、肺脏的湿重，计算心重比、肺重比。

1.3.4应用压力容积系统对大鼠左心室功能进行测定

开始前大鼠称重，用0.5%戊巴比妥钠(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉后，将其仰卧位固定于手术台上，颈部备皮消毒，在颈部正中切口，分离气管后插管，分离右颈总动脉，结扎颈总动脉远心端，用动脉夹夹毕颈总动脉近心端后，剪口插入Millar压力容积导管(SPR-838)，松开动脉夹结扎颈总动脉近心端，调整导管位置，缓慢插入左心室。在LabChart_v7.3.7软件平台中PVLoop_v2.0软件记录稳定状态下P-V波形的变化；腹部备皮消毒，腹部正中切口，分离下腔静脉后快速压闭下腔静脉(减少回心血量，暂时降低左心室前负荷)，记录P-V波形的变化；最后自下腔静脉快速注射10%NaCl溶液100 μL，记录P-V波形的变化。用肝素处理过的5 mL注射器下腔静脉取血，将血注入定标套件，取导管容积定标。

1.3.5应用labchart软件分析血流动力学参数

在LabChart_v7.3.7软件中，打开保存的数据，选取一段波形稳定的P-V环，对原始数据完成校正后，计算出稳定状态和改变前负荷时的心输出量(CO)、每搏出量(SV)、收缩末期容积(Ves)、舒张末期容积(Ved)、压力最大值(Pmax)、收缩末期压力(Pes)、舒张末期压力(Ped)、心率(HR)、搏出功(SW)、射血分数(EF)、左室压力最大上升速率(dP/dt max)、最大功率(PowMax)、左室压力最大下降速率(-dP/dt min)、压力衰退的时间常数(Tau)等血流动力学参数。

1.3.6血浆SOD、BNP和MDA的测定

在麻醉状态下，取大鼠下腔静脉血2 mL，4℃，3000 r/min，离心10 min，分离血浆，-80℃保存，严格按照试剂盒说明书添加标本和试剂，用7600-020全自动生化分析仪测定。

1.4统计方法

2　结果

2.1体重和器官重量

假手术组、心衰组和利拉鲁肽组大鼠在术后16周处死，分别称量体重、心脏和肺脏的重量。发现和假手术组相比，心衰组心脏和肺的重量都有增加，其中心脏和心重比有显著增加(P< 0.01，见表1)，肺脏和肺重比有明显增加(P< 0.05，见表1)。而利拉鲁肽组和心衰组相比，心脏重量明显减小(P< 0.05)，虽然体重和肺脏重量，以及心重比和肺重比都有所下降，但是并不明显(P> 0.05，见表1)。

2.2左心室舒缩功能

假手术组、心衰组和利拉鲁肽组大鼠左心室舒缩功能参数见表2。和假手术组大鼠比较，心衰组大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped、SW、Tau值均有明显增加(P< 0.05)，而dP/dt max、-dP/dt min、EF、SV和PowMax值则明显降低(P< 0.05)，心输出量(CO)虽降低，但并不明显(P> 0.05)。和假手术组比较，利拉鲁肽组大鼠的Ves、Ved、Pmax、Pes、Ped值均有明显降低(P< 0.05)，dP/dt max、-dP/dt min、EF和PowMax值则明显增加(P< 0.05)。

表1　各组大鼠体重和器官重量情况

注：*P< 0.05，**P< 0.01，与假手术组比较；#P< 0.05，与心衰组相比。

Note.*P< 0.05,**P< 0.01,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表2　各组大鼠左心室功能参数比较

注：*P< 0.05，与假手术组比较；#P< 0.05，与心衰组相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

表3　各组大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、B型钠尿肽(BNP)、丙二醛(MDA)的检测结果

注：*P< 0.05，与假手术组比较；#P< 0.05，与心衰组相比。

Note.*P< 0.05,compared with the sham group;#P< 0.05,compared with the HF group.

2.3利拉鲁肽对压力负荷型心衰大鼠血清中SOD、BNP、MDA的影响

各组大鼠血清中SOD、BNP、MDA的测定结果见表3。和假手术组相比，心衰组大鼠血清中的BNP和MDA明显增加(P< 0.05)，而SOD值则明显降低(P< 0.05)。和心衰组相比，利拉鲁肽组大鼠血清中的SOD值明显增加(P< 0.05)，BNP值则明显降低(P< 0.05)，MDA值有所下降，但并不明显。

3　讨论

心力衰竭是一种复杂的临床症状群，是由于各种原因导致的初始心肌损伤，进而引起心肌结构和功能的变化，最终导致心室收缩或舒张功能的低下。它是各种心脏病的严重阶段，具有很高的致残率及病死率。高血压造成的心脏压力负荷是导致心力衰竭的常见病因之一，在血压过高的情况下，心脏压力负荷过重，心室肌代偿性肥厚以保证射血量。持久的负荷过重，心肌必然发生结构和功能改变而导致失去代偿功能。容量超负荷是诱发心肌肥大和心力衰竭的常见原因之一。

肠促胰素胰升糖素样肽1(GLP-1)的药物不仅具有卓越的降糖效果，同时对心血管系统起到了一定的保护作用，利拉鲁肽作为GLP-1的代表药物，通过与遍布全身多种组织的GLP-1受体结合，发挥各种作用，尤其是对心血管的作用[9,10]。内质网应激是造成心肌细胞损伤的机制之一，糖尿病心肌病大鼠在经过利拉鲁肽治疗后，内质网应激标志物的表达水平明显降低，心肌细胞的凋亡也明显减少，并且它对心血管益处是独立于血糖调节机制的[4]。在心肌梗死小鼠模型中，在经过7 d的利拉鲁肽治疗后，心脏破裂发生率和心脏梗死面积都明显下降，并且心输出量增加[11]。但是，利拉鲁肽对于压力负荷型慢性心衰是否起作用，以及其具体机制仍有待进一步研究。

本研究通过对压力负荷型心衰大鼠给予利拉鲁肽治疗，和心衰组相比，利拉鲁肽组大鼠的心脏重量减少，说明利拉鲁肽在一定程度上减缓了心肌重构的发生。LV收缩功能参数Ves、Pes值在利拉鲁肽组有明显降低，表明利拉鲁肽组与心衰组大鼠达到相同Ves时需要比较少的Pes，同样，LV舒张功能参数Ved、Ped在利拉鲁肽组中降低，说明利拉鲁肽组的LV收缩和舒张功能都得到了一定程度的恢复。此外，利拉鲁肽组中反映心室排血功能的参数EF和PowMax值均明显增加，进一步说明了利拉鲁肽提高了心力衰竭大鼠的LV收缩与舒张功能。上述结果提示压力负荷型心衰大鼠在经过一段时间的利拉鲁肽给药之后，其LV的收缩与舒张功能都得到明显改善，甚至心室扩张情况也得到了缓解。

在血流动力学参数中，dP/dt max和-dP/dt min是描述心肌收缩和舒张变力性的重要指标，左室压力最大上升速率dP/dt max增大，心肌收缩功能增强。左室压力最大下降速率-dP/dt min增大，心肌舒张功能增强[12]。我们的数据表明利拉鲁肽显著的增强了心肌收缩和舒张的变力性，心脏损伤明显减少，心功能得到显著提升。

氧化应激是压力负荷型心力衰竭的重要机制，SOD是人体内主要的抗氧化酶，可清除自由基，其酶活性值的高低反映机体的抗氧化防御水平[13]，在本研究中，心衰组和假手术组相比，SOD值明显下降，提示心衰大鼠机体的抗氧化能力明显不足，而经过利拉鲁肽治疗，SOD值又明显回升，说明利拉鲁肽能够增强机体的抗氧化能力。

BNP是用来评价心力衰竭程度及预后状况的神经激素标记物，由心肌细胞分泌，有报道慢性心衰患者血浆BNP浓度比正常人高，而且与心力衰竭的严重程度呈正相关[14]。本研究表明，在大鼠心功能不全时，由于心室超负荷、心肌重构、肾素血管紧张素系统激活，BNP值显著增高，利拉鲁肽治疗后，随着心功能的改善BNP值明显下降。MDA是生物膜中不饱和脂肪酸发生了脂质过氧化性反应的最终产物，其浓度可间接反映细胞和组织功能损伤的严重程度。本实验结果利拉鲁肽组的MDA值低于心衰组，差异并不显著，提示利拉鲁肽并不是主要通过调节MDA含量来发挥抗心衰作用的。

总之，利拉鲁肽可以改善心衰大鼠左心室的收缩和舒张功能，减轻心肌细胞的损伤，其机制可能与抗氧化作用相关，具体机制还有待进一步研究。

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Liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure

WANG Chen-yang1, CAO Hai-tao1*, ZHANG Zhi-hua2, HUA Chuan3

(1. Department of Animal Experiment, No.252 Hospital of PLA, Baoding 071000, China;2. Department of Endocrinology, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China;3. Department of Clinical Laboratory, No. 252 Hospital of PLA, Baoding, 071000, China)

Objective To explore the effect of liraglutide on pressure-overload chronic heart failure in rats and related mechanisms. Methods Totally 30 SD rats were randomly divided into sham operation group, heart failure group and liraglutide group．The animals were anaesthetized and a Millar pressure volume conductance catheter SPR-838) was inserted through right carotid artery into LV to measure pressure-volume (P-V) loop．Body and organ weight were measured. After the end of intervention, the rats were anesthetized, and abdominal aortic blood taken from the upper serum after centrifugation. Kit method was used to measure superoxide dismutase (SOD), brain natriuretic peptide (BNP), malondialdehyde (MDA)．ResultsCompared with those of the sham operation group, there was a increase in absolute heart weight and (P< 0.05). During the P-V loop analyses, We found that left ventricular (LV) end-systolic volume, end-diastolic volume, end-systolic pressure, end-diastolic pressure and maximum pressure were all remarkablely lower in liraglutide group than HF group in rats (P< 0.05). Peak rate of pressure rise (dP/dt max), peak rate of pressure decline (-dP/dt min), ejection fraction and Maximum Power were increased in liraglutide group comparable by HF group (P< 0.05). SOD activity was significantly increased and BNP concentration was significantly decreased in liraglutide group compared to HF group (P< 0.05). ConclusionsThese results show that liraglutide protects pressure-overload rat heart from failure possibly through reducing oxidation．

Liraglutide; Pressure-overload; Heart failure

王晨阳(1980-)，女，硕士生，助理研究员，专业：实验病理与比较医学。E-mail: wangbio_2004@163.com。

曹海涛(1979-)，男，主管技师，研究方向：心血管病检验与临床研究。E-mail: cht252@163.com。

研究报告

R-332

A

1671-7856(2016)09-0064-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.09.012

2016-03-20