温度控制对分光光度法测定pH的影响

刘　玉，司玉洁，赵宇梅，王　宁

（国家海洋技术中心，天津　300112）

温度控制对分光光度法测定pH的影响

刘玉，司玉洁，赵宇梅，王宁

（国家海洋技术中心，天津300112）

海洋中二氧化碳含量增加，使得海洋生态环境发生变化。海洋碳循环及海洋酸化的监测数据是评估生态环境变化的重要指标，pH作为一项碳循环监测重要指标，其测量的精度指标要求达到千分之五，传统意义上的敏感电极法测量海水中pH测量精度为±0.2，已不能满足海水碳循环监测的要求，分光光度法测定海水pH无需校正，精密度±0.005，该方法可用于碳循环船基监测和岸基监测。分光光度法测定海水pH，测量环境和样品恒温于25℃，一般商用分光光度计无恒温功能，本研究通过恒温水循环系统，对分光光度计舱内侧壁及比色皿架外壁进行恒温设计，准确控制温度。结果表明，标准缓冲溶液在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃下，pH随温度呈线性变化、5组实测pH值与公式计算理论值差值无显著差异。在25.0℃测定5个不同海水样本pH，均得到了稳定数值。

温度控制；分光光度法；pH测定

pH是海洋碳循环体系的重要参数之一，在海洋监测中具有重要意义。对pH进行长期连续高精度监测，可以为海洋碳循环和海洋酸化的研究提供基础数据。目前，测量海水pH的主要方法有电极电位法和分光光度法。电极电位法发展较早，现已应用到海水pH的常规现场原位测量中，但该方法受电极漂移和校准技术等影响，测量精度相对较低，在长期连续监测中受到了一定限制。分光光度法测量海水中pH值从20世纪80年代末开始发展，该方法准确度与精密度较高，并且无需校正，已在国外得到广泛应用［1］。

分光光度法测量pH是由分光光度计测量样品加入显色剂前后变化情况来判定样品中所含［H+］，由此得到所测样品的pH值。

分光光度法pH测定的二级解离过程如式（1）所示：

式中：“I”代表显色剂，在海水样品中的含量很低。样品的总氢离子浓度由式（2）所示：

该方法的原理是基于不同形式的显色剂具有不同的吸收光谱。因此，组合光谱里的信息可以用来估算［I2-］/［HI-］。

朗伯－比尔定律给出了单个波长，λ的吸光值，光程为1。

式中：βλ与样品的背景吸收有关；e是由于仪器噪音所造成的误差项。消光系数的值：ελ（HI-）及ελ（HI2-）作为波长的函数已测量，那么，双波长以及多波长吸光率的测量可用来估算［I2-］/［HI-］的比值。

在仅有双波长的情况下，假设背景可以通过一个负的程序得以消除，式（3）可以经重新整理得到（假设不存在实验误差）：

式中：1、2分别为不同的波长；ε为特定物质在波长1和2处各自的消光系数。

采用间甲酚紫作为显色剂的分光光度法测定海水的pH范围是7.90～8.40。可完成从表层至深层海水pH测定，精密度达0.000 4 pH，该方法在国外20世纪90年代早期已得到广泛的应用。近些年来，国内外科研人员也在不断的完善此测量方法，使得pH测量达到碳循环等缓慢生态环境变化对其高精度的要求。Wensheng Yao研究发现指示剂如间甲酚紫不纯对测定海水pH有一定影响［2］。Xuewu Liu等利用高效液相色谱法（HPLC）对间甲酚紫指示剂进行纯化［3］，使用纯化后的间甲酚紫用分光光度法测定海水pH以提高测量精度。Mark C等利用快速色谱法对间甲酚紫和甲酚红进行更有效的纯化，从而提高分光光度法测定海水pH的精度［4-5］。

在Guide to best practices for oceanC O2me asurement一书中规定的分光光度法测定海水pH过程中，测量环境和样品恒温于25℃，一般商用分光光度计无恒温功能，因此操作过程中温度的控制成为制约该方法推广应用的关键［1］。从式（6）中可知温度变化对海水pH影响较大，指导手册提出了在恒温条件下完成分光光度测量海水pH，但商用分光光度计未设置恒温装置，分光光度计就温度控制方面也未进行针对性设计，导致机器内部温度难对待测液体影响较大，控制温度已成为分光光度法准确测定pH的主要问题。目前控温措施，多采用恒温水浴及空调控制室内温度来达到待测液温度控制，而仪器内部温度变化所及室内人员流动带来的室内温度变化，导致了温度控制效果欠佳。孙墨杰［6］利用半导体制冷片来控制pH测定温度，有效地提高了pH计的测量精确度。厦门大学李权龙等采用将自行研制的小型分光光度计测量单元全部至于恒温箱中，实现恒温测量。

本研究是在分光光度计中增加控温系统，通过将光度计舱内搭建水冷装置控制分光光度计舱内温度，水浴功能对待测水样进行预热，在恒温恒湿实验室中，准确控制pH测定的环境温度，提高该方法准确度，保障该方法测定pH可以在实验室中有效运行，为高精度海水pH测定提供可靠数据，为海水酸化等长期海水pH监测项目提供保障技术。

1　恒温测定海水样品pH

1.1实验设备与实验试剂

设备：紫外可见分光光度计（GBC Cintra2020）；可控温恒温水浴；电子分析天平（梅特勒-托利多XS205DU）；水银温度计（精度0.1℃）。

试剂：间甲酚紫（分子量382.43）；海水pH缓冲溶液（成分：MgCl2·6H2O，CaCl2，NaCl，KCl，Na2SO4，MgCl2，HCl，TRIS等试剂，依据Guide to best practices for ocean CO2measurement自行配制）；东印度洋、三亚、宁波、青岛、塘沽等不同海域的海水作为待测样品。超纯水，由普希（GWA-UN2）制造。

1.2数据分析方法

所有数据均以“平均值±标准差”表示。采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析。统计分析前，采用Levene’S法进行方差齐性检验，当不满足齐性方差时，对数据进行反正弦或平方根处理。采用单因子方差分析（One way ANOVA）对实验结果进行分析，用Tukey法进行多重比较，以P＜0.05为差异显著性标准。

1.3实验步骤

设定恒温系统至实验温度，将待测样品加入比色皿并于恒温系统水浴槽中预热，每个恒温点控温10 min，分别在434 nm，578 nm和730 nm测定海水pH缓冲溶液的吸光值；然后将样品倒入试管并加入2 mmol/L间甲酚紫0.05～0.1 mL搅拌均匀，分别测定缓冲溶液加入间甲酚紫显色后434 nm，578 nm，730 nm 3个波长下的吸光值。在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5个温度梯度点重复上述实验步骤。在恒温25℃条件下，对东印度洋、三亚、宁波、青岛、塘沽等5个不同海域的海水进行pH测定。

分别控制温度在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃测定自行配置的海水pH缓冲溶液的pH值，与其理论值进行对比，研究同一溶液在不同温度下对其pH测量的影响；恒温25℃下，测定该缓冲溶液pH稳定性并与同条件下未控温该缓冲溶液pH稳定性进行对比；测定不同温度对pH的影响，设定25℃及临近的4个温度（24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃）对测定海水pH缓冲溶液的pH值与对应温度的理论值进行对比；恒温25℃，测定东印度洋、三亚、宁波、青岛、塘沽等不同海域的海水pH。以上实验均设置5个平行样进行分析。通过上述实验，分析通过增加温度控制装置前后变化对分光光度计测量的影响。

2　结果与讨论

2.1不同温度下对标准溶液pH测定

在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5个温度梯度点，观察海水pH缓冲溶液在不同温度下的线性关系，实验结果如图1显示，该缓冲溶液pH值随温度升高而降低，由8.087 8（24.0℃）降至8.02（26.0℃），在该区间内pH与温度呈线性关系该结果同式（6）理论值法计算相关性为R=0.994 5。有效控制了实验温度，为实验提供了良好的恒温条件，提高了结果的准确度。

图1　不同温度下pH标准缓冲溶液pH值

2.2控温与未控温条件下pH测定

利用海水pH缓冲溶液进行了控温与未控温条件下的测定。将比色皿放入舱内连续进行5次测定，结果如图2所示是控温后实验数据变化范围较小（8.051～8.053），而未进行控温实验组则pH值降低了0.022（8.054降至8.032）。通过控温装置对分光光度计进行控温，提高了测量的重现性。

图2　控温对pH测定的影响

2.3不同温度下pH标准缓冲溶液实测值与计算值偏差

分光光度法测定pH值是通过测定吸光度变化计算而来，在一定温度下可以通过设置温度系数得到理论值，测定值与理论值存在偏差，图3为该差值在24.0℃～26.0℃之间的5个温度无显著差异（p＞0.05）。pH理论值通过式（6）计算所得，如表1所示。

图3　不同温度测量值与推导致差值

表1　通过公式计算pH理论值

2.4分光光度法测量结果

采用分光光度法分别对东印度洋、三亚、宁波、青岛、天津5个水样在25.0℃进行测量，实验结果如表2所示。在不同地区水样测试中，均能表现出较好的重复性，结果稳定。

表2　分光光度法测量结果

3　结论

目前使用分光光度法测定pH方法均通过样品水浴及实验室恒温来达到最大程度的控制温度在25℃，但分光光度计测量量过程中仪器自身发热对实验结果的影响难以控制。本项研究是通过加入仪器内部水循环控制来进行控温，提高了测量过程中温度控制的稳定性，保证了数据的准确可靠。并且通过在24.0℃，24.5℃，25.0℃，25.5℃和26.0℃5个温度下进行的多组实验，控温系统的搭建改善了温度对pH测定的影响，减少分光光度计测量海水pH过程中实际操作带来的测量误差，提高了测量精密度。

［1］Dickson A G，Sabine C L，Christian J R.Guide to Best Practices for Ocean CO2Measurements［M］.North Pacific Marine Science Organization，2007.

［2］Clayton T D，Byrne R H.Spectrophotometric Seawater pH Measurements:Total Hydrogen Ion Concentration Scale Calibration of M-Cresol Purple and At-Sea Results［J］.Deep Sea Research Part I:Oceanographic Research Papers，1993，40（10）:2115-2129.

［3］YaoW，XLiu，R H Byrne.Impurities in Indicators Used for Spectrophotometric Seawater pH Measurements:Assessment and Remedies［J］.Marine Chemistry，2007，107（2）:167-172.

［4］Xuewu Liu，Mark CPatsavas，Robert H Byrne.Purification and Characterization ofMeta-Cresol Purple for Spectrophotometric Seawater pH Measurements.Environmental Science and Technology，2011，45（11）:4862-4868.

［5］Mark C Patsavas，Robert H Byrne，Xuewu Liu.Physical Chemical Characterization of Purified Cresol Red for Spectrophotometric pH Measurements in Seawater［J］.Marine Chemistry，2013，155:158-164.

［6］孙墨杰，陈长安.在线恒温pH计的研究［J］.东北电力学院学报，2001，21（2）:24-27.

Study on the Effect of Temperature Control on pH Measurement by the Spectrophotometric Method

LIU Yu，SI Yu-jie，ZHAO Yu-mei，WANG Ning
National Ocean Technology Center，Tianjin 300111，China

The increasing content of carbon oxide in seas and oceans has led to changes in marine ecological environment.The monitoring data of marine carbon cycle and ocean acidification are significant indicators used to evaluate the change of ecological environment in seas and oceans.As an important indicator，pH is to survey the carbon cycle，with its measuring accuracy being demanded to reach 5‰.So far，the accuracy of marine pH measured by the traditional sensitive electrode measurement method is±0.2，not able to meet the requirement of seawater carbon cycle monitoring.However，the accuracy of the spectrophotometric method is±0.005 and it needs not to be calibrated to measure marine pH.So the spectrophotometric method has been used in ship and shorebased monitoring on carbon cycle.In the Guide to best practices for ocean CO2measurement，the temperature of the environment and samples to be measured is stipulated to be kept at 25℃when the spectrophotometric method is adopted to measure the pH of seawater.However，the temperature can not be controlled using ordinary commercial spectrophotometers.Therefore，temperature control becomes the key factor restricting the development and application of the spectrophotometric method.In this study，the constant temperature system of water cycle is applied to design the chamber wall of the spectrophotometer and the outer wall of the cuvette holder to control the temperature.The results show that pH has linear change with changing temperature when the standard buffer solution is at the temperature of 24.0，24.5，25.0，25.5 and 26.0℃.No significant difference is observed between the pH values of the five groups and the theoretical values calculated from the formula.Besides，the pH values of different seawater samples measured at 25.0℃are all stable.

temperature control；spectrophotometric method；pH measurement

X834

A

1003-2029（2016）03-0094-04

10.3969/j.issn.1003-2029.2016.03.018

2015-09-18

国家自然科学基金资助项目（41206083）；天津科技兴海项目资助（KJXH2013-21）

刘玉（1987-），男，硕士，研究方向为海洋环境监测技术。E-mail：liuyu18@foxmail.com