侧孢芽孢杆菌C5发酵条件及培养基的优化

吴迎奔，陈 薇，贺月林，许丽娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

侧孢芽孢杆菌C5发酵条件及培养基的优化

吴迎奔，陈 薇，贺月林，许丽娟，王 震，汪 彬

（湖南省微生物研究院，湖南 长沙 410009）

为了更加有效地利用侧孢芽孢杆菌C5，研究了该菌株的生长特性，并对其发酵条件及培养基进行了优化。结果表明，侧孢芽孢杆菌C5的生长规律为：0～4 h延滞期，4～16 h指数期，16 h后进入稳定期；最佳发酵条件为：初始pH值7.0、培养温度30℃、接种量3%～5%、转速180 r/min；最适培养基为：葡萄糖20.0 g/L、酵母膏10.0 g/L、MnSO40.2 g/L、CaCl20.3 g/L、KH2PO40.1 g/L、MgSO40.05 g/L。在上述条件下，侧孢芽孢杆菌C5的发酵芽孢数可达1.08×109CFU/m L。

侧孢芽孢杆菌；发酵；条件；培养基；优化

芽孢杆菌已广泛应用于农业［1-3］、医药卫生［4］等领域，其中侧孢芽孢杆菌具有解磷钾、固氮等生物学特性［5-8］，能产生具有应用潜力的代谢产物，例如杀虫蛋白、抑菌物质等［9］。国内外对侧孢芽孢杆菌的研究主要集中于杀虫［10］、保健类药物［11］的开发等方面。由湖南省微生物研究院筛选的侧孢芽孢杆菌C5，被证实可抑制水体中有害微生物的生长，并能有效分解水中的有机质，净化水质［12］。现对该菌株的生长特性进行研究，并在此基础上对其产芽孢发酵培养基进行优化，为其产业化发展提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试侧孢芽孢杆菌C5由湖南省微生物研究院筛选。供试培养基有：（1）LB培养基，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，蒸馏水1 L，pH 值7.0；（2）基础发酵培养基，葡萄糖10 g，酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 0.5 g，蒸馏水1 L，pH值7.0～7.2；（3）发酵培养基，根据需要具体配制。

1.2 试验方法

1.2.1 生长曲线测定 从LB斜面挑取一接种环的菌苔接种于100 m L基础发酵培养基中，于30℃、180 r/ min恒温摇床震荡培养48 h。培养期间每隔3 h取液态样品测定菌体生长吸光度（OD600）。

1.2.2 芽孢杆菌菌种制备 将斜面菌种接种1环至液体种子培养基中，培养至对数期。以1%接种量转接到装有100 m L发酵液的500 mL三角瓶中，37℃、180 r/m in培养10 h。

1.2.3 细菌数、芽孢数的测定 细菌浓度采用细菌计数板计数法测定；发酵液产芽孢率（芽孢数）采用结晶紫染色法测定［12］。

1.2.4 发酵条件的优化 （1）初始pH值的选择。调基础培养基的pH值分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，按1%的接种量接种，37℃，180 r/m in发酵培养24 h，测定发酵液的芽孢数，确定最佳初始pH值。（2）温度的选择。按1%接种量将种龄18～22 h的种子液转接到最佳初始pH值的基础培养基上，分别置于25、30、35、40和45℃摇床上发酵培养，转速为180 r/ min，发酵培养24 h后测定发酵液的芽孢数，确实最适培养温度。（3）接种量的选择。在最佳初始pH值条件下，分别接种1%、3%、5%、7%、10%的种子液于最佳温度培养下以180 r/m in的转速发酵培养24 h，测定发酵液的芽孢数，确实最佳接种量。（4）转速的选择。在最佳初始pH值和最佳接种量的基础上，分别以120、150、180、210 r/min的转速于最佳温度培养下发酵培养24 h，测定发酵液的芽孢数，确定最佳转速。

1.2.5 发酵培养基的优化 （1）碳源。分别用10 g/L葡萄糖、淀粉、蔗糖和玉米淀粉作为碳源，其他组分不变，在最佳发酵条件下培养24 h后测定发酵液中芽孢杆菌活菌数和芽孢形成率［5-6］，确定最佳碳源。（2）氮源。分别以10 g/L尿素、牛肉膏、工业蛋白胨、酵母膏4种氮源作为唯一氮源进行发酵培养，在最佳发酵条件下培养24 h后测定发酵液中芽孢杆菌活菌数和芽孢形成率，确定最佳氮源。

1.2.6 正交试验 在单因素试验基础上，以发酵液中芽孢杆菌芽孢数为考察指标，以玉米淀粉为碳源，酵母膏为氮源，CaCl2和MnSO4为无机盐因素，设计正交试验（表1），应用L9（34）正交表对各组分用量进行优化。

表1 芽孢杆菌发酵培养基正交试验设计 （g/L）

2 结果与分析

2.1 生长曲线

由图1可知，侧孢芽孢杆菌C5的生长规律为：0～4 h延滞期，4～16 h指数期，16 h后进入稳定期，由于后期形成大量芽孢，OD值变化不明显。

图1 侧孢芽孢杆菌C5生长曲线

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 初始pH值 从图2可知，当初始pH值为7.0时，发酵24 h后侧孢芽孢杆菌C5的菌体数和芽孢数均达到最多，分别为8.6×108和6.6×108CFU/mL，初始pH值太高或太低均不利于菌体生长和芽孢形成。

图2 不同pH值对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.2.2 培养温度 由图3可知，当培养温度为30℃时，侧孢芽孢杆菌C5的菌体数和芽孢数达到最高，分别为9.3×108和7.3×108CFU/m L。

图3 不同温度对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.2.3 接种量 从图4可知，在一定范围内，侧孢芽孢杆菌C5发酵液中的菌体数和芽孢数随接种量的增加而增加，但当接种量＞5%时，菌数和芽孢数呈下降趋势。因为3%接种量和5%接种量菌数及芽孢数差别不大，从经济角度出发，在后续试验中选择3%的接种量。

图4 不同接种量对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.2.4 转 速 如图5所示，当摇床转速为180 r/min时，侧孢芽孢杆菌C5的菌体数和芽孢数均最多。故将侧孢芽孢杆菌C5的摇床转速确定为180 r/min。

图5 不同转速对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.3 发酵培养基的优化

2.3.1 碳 源 从图6中可以看出，不同碳源对侧孢芽孢杆菌C5发酵的菌体数和芽孢数有不同的影响，其中葡萄糖作为碳源的效果最好，发酵结束后菌体书和芽孢数分别为1.23×109和9.7×109CFU/mL，因此选择葡萄糖为侧孢芽孢杆菌C5培养基的碳源。

图6 不同碳源对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.3.2 氮 源 由图7可知，侧孢芽孢杆菌C5在含有酵母膏的培养基中活菌数、芽孢数最高，分别达1.39×109和1.03×108CFU/m L，因此选择酵母膏作为侧孢芽孢杆菌C5培养基的碳源。

图7 不同氮源对侧孢芽孢杆菌C5生长的影响

2.4 正交试验结果

由表2可知，影响侧孢芽孢杆菌C5发酵水平主次因素关系为：葡萄糖＞酵母膏＞MgSO4＞CaCl2，因素间最佳水平组合为A3B2C3D3。结合无机盐的筛选，添加其他3种可以提高发酵水平的无机盐，侧孢芽孢杆菌C5的最佳发酵培养基为：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在此条件下，侧孢芽孢杆菌C5的发酵芽孢数可达1.08×109CFU/m L。从表3的方差分析结果可知：F葡萄糖=58.597＞F0.05（2，2）=19.00，说明葡萄糖的作用达到显著水平。因此，在发酵过程中要严格控制葡萄糖的用量，其他因素的作用未达显著水平。

表2 侧孢芽孢杆菌C5培养基浓度的正交试验结果

表3 侧孢芽孢杆菌C5正交试验方差分析

3 结 论

选取物料投入产出比高，适宜工业化发酵，来源容易、价格低廉、菌体数和芽孢数高的葡萄糖作为培养基中的碳源成分，酵母膏作为培养基中的氮源成分。试验结果表明，侧孢芽孢杆菌C5的生长规律为：0～4 h延滞期，4～16 h指数期，16～32 h稳定期，32 h以后衰亡期；最佳发酵条件为：初始pH值 7.0，培养温度30℃，接种量3%～5%，转速180 r/min；最适培养基为：葡萄糖20.0 g/L，酵母膏10.0 g/L，MnSO40.2 g/L，CaCl20.3 g/L，KH2PO40.1 g/L，MgSO40.05 g/L。在上述条件下，侧孢芽孢杆菌C5的发酵芽孢数可达1.08×109CFU/m L。

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（责任编辑：成 平）

Optim izing Fermentation Condition for Bacillus laterosporus C5

WU Ying-ben，CHEN Wei，HE Yue-lin，XU li-juan，WANG Zhen，WANG Bin
（Hunan Institute of Microbiology， Changsha 410009， PRC）

In order to use Bacillus laterosporus C5 efficiently in production， the Growth characteristics were studied， and the liquid fermentation medium and fermentation conditions were optim ized. The results show ed that the optimal fermentation conditions were initial pH 7.0， temperature 30 ℃， inoculation rate 3%-5%， and rotate speed 180 r/min； the optimum medium was glucose 20.0 g/L， yeast extract 10.0 g/L， MnSO40.2 g/L， CaCl20.3 g/L， KH2PO40.1 g/L， MgSO40.05 g/L. Under the conditions， the spore yield with optimum medium formula was up to 1.08×109CFU/m L。

Bacillus laterosporus； fermentation conditions； condition； culture medium； orthogonal optimization

Q939.96

A

1006-060X（2016）09-0004-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2016.09.002

2016-07-14

湖南省科技计划（2015CK3008）；湖南省生猪产业技术体系生猪产业规模养殖与环境控制岗位项目

吴迎奔（1981-），男，湖南新化县人，助理研究员，主要从事农业微生物等相关研究。

汪 彬