基底细胞样乳腺癌老年患者Ki-67表达与TopoⅡα、C-MYC基因的相关性

李春燕　李春旭　杨　帆

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江　齐齐哈尔　161006)



基底细胞样乳腺癌老年患者Ki-67表达与TopoⅡα、C-MYC基因的相关性

李春燕李春旭1杨帆

(齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心，黑龙江齐齐哈尔161006)

目的探讨基底细胞样乳腺癌(BLBC)和非BLBC(NBLBC)癌组织中TopoⅡα、C-MYC基因扩增与Ki-67表达的关系。方法该院临床病理诊断中心经石蜡包埋的乳腺癌组织，其中100例BLBC癌组织、100例NBLBC癌组织，对照组选取100例同期周围正常乳腺组织。结果TopoⅡα与C-MYC基因改变类型主要为扩增与缺失，TopoⅡα、C-MYC和Ki-67在对照组表达不显著。100例BLBC病理组织中，TopoⅡα与C-MYC基因扩增分别为43例和51例，缺失分别为57例49例；Ki-67阳性76例，阴性24例；TopoⅡα、C-MYC基因扩增与Ki-67表达在Spearman等级相关分析中有统计学意义(P<0.05)。100例NBLBC病理组织中，TopoⅡα与C-MYC基因扩增分别为34例和43例，缺失66例和57例；Ki-67阴性16例，阳性84例；Spearman等级相关分析，TopoⅡα、C-MYC基因扩增与Ki-67表达相关(P<0.05)，TopoⅡα与C-MYC基因扩增呈正相关(P<0.05)。与NBLBC比较，BLBC的TopoⅡα与C-MYC基因扩增略多。结论TopoⅡα、C-MYC基因扩增与Ki-67相关。与NBLBC比较，BLBC癌组织的TopoⅡα、C-MYC基因扩增较多，TopoⅡα与C-MYC基因扩增可能参与乳腺癌的发生发展过程。

乳腺癌；TOP2A；C-MYC；Ki-67

我国老年女性乳腺癌发病率最高〔1〕。乳腺癌按cDNA组织芯片基因表型分为基底细胞样乳腺癌(BLBC)和非基底细胞样乳腺癌(NBLBC)两类，BLBC约占25%，其特点为强侵袭性和恶性程度高，患者术后易出现复发和转移，导致生存质量下降、预后差及病死率增高。本文采用荧光原位杂交方法(FISH)和免疫组化(ICC)检测BLBC癌组织拓朴异构酶(Topo)Ⅱα和细胞原癌基因(C-MYC)的扩增情况及细胞增殖因子(Ki-67)的表达，同时探讨三者之间的关系。

1　资料与方法

1.1一般资料选取2010年2月至2014年8月齐齐哈尔医学院临床病理诊断中心经石蜡包埋的癌组织，其中100例BLBC癌组织、100例NBLBC癌组织，同时选取100例同期周围正常乳腺组织作为对照组。所有患者均符合乳腺癌诊断标准，为首次诊治的女性，研究开始前告知患者及其监护人本研究的目的及意义，患者在知情同意书上签字，并严格保守患者个人信息，得到伦理委员会批准后进行研究。两组年龄、体重指数等基本资料无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1　BLBC和NBLBC两组基本情况比较

1.2仪器和试剂采用杭州朗基科学仪器有限公司基因扩增仪MCC96+；荧光原位杂交和染色体核型分析采用美国IMSTAR全自动荧光原位杂交扫描分析系统Pathfinder FISH；小鼠抗人Ki-67单克隆抗体来自上海微蒙生物科技有限公司；TopoⅡα和C-MYC基因扩增检测(FISH法)采用上海信裕生物技术有限公司的试剂盒及其相应配套试剂。

1.3检测方法

1.3.1Envision检测Ki-67在乳腺组织的表达将乳腺组织石蜡切片脱蜡，高压锅内放入乙二胺四乙酸(EDTA)修复液，将切片置入其中修复3 min后用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，在3%H2O2溶液中浸泡10 min，再用PBS冲洗，然后加入一抗，4℃静置10 h后用PBS冲洗，加入二抗，放入恒温箱中37℃静置40 min后用PBS冲洗，最后加入二氨基联苯胺(DAB)显色液，进行观察。

Ki-67在乳腺癌组织的阳性判断：当出现黄色颗粒时Ki-67胞核表达为阳性，按着色的细胞染色强度分级：深褐色为3分；棕黄色为2分；浅黄色为1分。阳性细胞所占百分比分级：阳性细胞占总细胞比例>51%为3分；占总细胞比例26%～50%为2分；占总细胞比例6%～25%为1分；占总细胞比例<5%为0分。着色强度+阳性细胞百分比为Ki-67阳性表达级别：“”为5～6分；“” 为3～4分；“+”为2分；“-”为0～1分。

1.3.2TopoⅡα和C-MYC基因检测采用FISH法进行检测，将厚度为4 μm的切片脱蜡后置入甲醇溶液中，浸泡5 min后取出，干燥15 min，放入甲酸混合液(浓度85%)中暗处静置20 min，4% HCl漂洗5 min，置于含4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液梯度脱水，干燥20 min，置于硫氰酸钠(NaScN)液80℃加热10 min，4% HCl漂洗。4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液脱水，晾干。蛋白酶工作液37℃加热10 min，4% HCl漂洗10 min，4%HCl 70%～100%系列乙醇溶液脱水，晾干，加固定液3.7%甲醛PBS溶液静置15 min后，在PBS溶液中漂洗15 min，用超纯水漂洗10 min，用中性系列乙醇溶液(浓度为70%～100%)脱水。晾干后加入10 μl探针(TopoⅡα或C-MYC)和盖玻片，80℃烘干5 min，然后放入37℃恒温箱中杂交。10 h后取出浸泡在PBS液中，去掉盖玻片，将恒温箱调至42℃，用PanWash洗液孵育，5 min后用PBS液冲洗，中性70%～100%系列乙醇溶液脱水，晾干，甘油明胶封片，荧光显微镜下观察。基因扩增阳性判定：通过查找基因杂交信号，分别标记17号染色体(绿色)、TopoⅡα基因(红色)、8号染色体(蓝色)、C-MYC基因(黄色)。在激光共聚焦显微镜下随机查找30个双色信号的癌细胞核。统计Ratio值，即30个细胞核中红(黄)/绿(蓝)比值，若Ratio(红/绿)<1.8，表示TopoⅡα无基因扩增；Ratio(红/绿)>2.2时，说明TopoⅡα基因扩增。当Ratio(黄/蓝)<1.8，表示C-MYC无基因扩增；当Ratio(黄/蓝)>2.2，说明样本中C-MYC基因扩增。

1.4统计学方法应用SPSS18.0软件行方差分析、等级相关分析。

2　结　果

2.1Ki-67分级与TopoⅡα基因扩增的相关性分析TopoⅡα基因改变以扩增与缺失为主，对照组很少有TopoⅡα和Ki-67表达。BLBC组及NBLBC组中扩增分别占43.0%、34.0%，缺失分别占57.0%、66.0%。等级相关分析(Spearman)显示，BLBC、NBLBC病理组织TopoⅡα基因扩增随Ki-67分级增高而增加，呈正相关(r=0.58，0.53；P<0.05)；基因缺失均与Ki-67分级无关联(P>0.05)。两组比较，BLBC组的TopoⅡα基因扩增多于NBLBC组。见表2。

2.2Ki-67分级与C-MYC基因扩增的相关性分析见表3。扩增与缺失是C-MYC基因主要改变类型，对照组很少出现C-MYC扩增或缺失。BLBC组及NBLBC组中扩增分别占51.0%、43.0%、缺失分别占49.0%、57.0%。等级相关分析(Spearman)显示，BLBC、NBLBC组C-MYC基因扩增与Ki-67呈正相关，随分级增加而升高(r=0.56，0.52；P<0.05)；基因缺失均与Ki-67分级无关联(P>0.05)；两组相比，BLBC组的C-MYC基因扩增多于NBLBC组。

表2　Ki-67与TopoⅡα在BLBC、NBLBC基因扩增中的相关性〔n(%)〕

表3　Ki-67与C-MYC在BLBC、NBLBC基因扩增中的相关性〔n(%)〕

2.3BLBC的TopoⅡα基因与C-MYC基因扩增相关性BLBC病理组织基因扩增中，TopoⅡα、C-MYC共同扩增29例，共同缺失35例，TopoⅡ扩增、C-MYC缺失14例，TopoⅡα缺失、C-MYC扩增22例。TopoⅡα与C-MYC在BLBC基因扩增中有关(r=0.59，P<0.05)。

2.4NBLBC的TopoⅡα基因与C-MYC基因扩增相关性分析NBLBC病理组织基因扩增中，TopoⅡα、C-MYC共同扩增23例，共同缺失46例，TopoⅡα扩增、C-MYC缺失11例，TopoⅡα缺失、C-MYC扩增20例。TopoⅡα与C-MYC在NBLBC基因扩增有关(r=0.61，P<0.05)。

3　讨　论

Ki-67仅在增殖细胞表达，因此，可作为反映肿瘤细胞增殖活性的标志物，与多种肿瘤的发生、发展、转移与预后密切相关〔2～6〕。本研究表明，TopoⅡα与C-MYC基因水平变化对乳腺癌的靶向治疗具有参考价值〔7〕。

DNA拓扑异构酶按功能可分TopoⅠ和TopoⅡ，其中TopoⅡ亚单位包括α与β，TopoⅡα与乳腺癌密切相关，位于17号染色体上，TopoⅡα作为拓扑异物酶的编码基因，对核酸生理功能具有调控作用，合成酶和水解酶在细胞分裂中扮演重要角色，由ATP提供能量，表现为：①DNA拓扑结构改变可以通过偶联反应途径催化DNA链结合或断开；②作用于核酸磷酸价键，影响DNA超螺旋和解旋状态间的转换，参与DNA复制与修复。本次研究中，TopoⅡα基因扩增BLBC高于NBLBC，表明癌基因激活机制包括TopoⅡα基因扩增，在临床同一分期患者中，TopoⅡα基因扩增存在差异，从侧面表明乳腺癌转归不同，表明乳腺癌发生过程中TopoⅡα基因会扩增〔8〕。但有学者认为，乳腺癌的病理改变与TopoⅡα基因扩增并没有显著的相关性，其敏感性高低不能作为蒽环类化疗药物标志物〔9〕。笔者认为，检测方法是导致差异的主要因素，需要采用不同检测方法并增加样本量来进行验证。

C-MYC基因属于MYC基因组，人的C-MYC基因在染色体的8q24区，其组成包括外显子3个和内含子2个，其中第1外显子只能调节转录控制区，无编码序列，2、3外显子核蛋白能够与DNA结合，进行核内信息传递。C-MYC基因在激活状态下可与ras癌基因产生协同作用，阻碍p15、p21 等因子表达，促使细胞增殖速度加快和细胞分化速度降低，最终导致细胞凋亡、恶性肿瘤形成。研究发现C-MYC基因在很多肿瘤中均可表达过度，并且是永生癌基因，尤其在癌变早期和肿瘤启动呈现异常激活状态，可作为早期乳腺癌病变观察指标，其表达水平与肿瘤发生发展、浸润侵袭等过程密切相关。乳腺癌合并C-MYC基因扩增后，可能导致乳腺癌化疗药物耐受。有研究显示，抑制C-MYC水平，阿霉素类药物治疗乳腺癌患者敏感性显著提高〔2，10〕，C-MYC基因在BLBC中扩增高于NBLBC。

综上所述，TopoⅡα基因与C-MYC基因扩增在BLBC与NBLBC中呈正相关，在靶向治疗中，若其中一种基因水平下降，另一种基因也随之下降。但尚未有文献报道两者之间的关联，仍需深入探讨。

1Alkam Y,Mitomi H,Nakai K,etal.Protein expression and methylation of DNA repair genes hMLH1,hMSH2,MGMT and BRCA1 and their correlation with clinicopathological parameters and prognosis in basal-like breast cancer〔J〕.Histopathology,2013;63(5):713-25.

2 Kang J,Sergio CM,Sutherland RL,etal.Targeting cyclin-dependent kinase 1(CDK1) but not CDK4/6 or CDK2 is selectively lethal to MYC-dependent human breast cancer cells〔J〕.BMC Cancer,2014;14(1):32.

3 Criscitiello C,Disalvatore D,De Laurentiis M,etal.High Ki-67 score is indicative of a greater benefit from adjuvant chemotherapy when added to endocrine therapy in luminal B HER2 negative and node-positive breast cancer 〔J〕.Breast,2014;23(1):69-75.

4Christgen M,Winkens W,Kreipe HH.Determination of proliferation in breast cancer by immunohistochemical detection of Ki-67〔J〕.Pathologe,2014;35(1):54-60.

5Lee SK,Kim SW,Han SA.The protective effect of parity in hormone receptor-positive,Ki-67 expressing breast cancer〔J〕.World J Surg,2014;38(5):1065-9.

6González-Sistal A,Sánchez AB,Del Rio MC,etal.Association between tumor size and immunohistochemical expression of Ki-67,p53 and BCL2 in a node-negative breast cancer population selected from a breast cancer screening program〔J〕.Anticancer Res,2014;34(1):269-73.

7 Janghorban M,Farrell AS,Allen-Petersen BL,etal.Targeting c-MYC by antagonizing PP2A inhibitors in breast cancer〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2014;111(25):9157-62.

8 Biesaga B,Niemiec J,Ziobro M.BCL-2,topoisomerase Ⅱα,microvessel density and prognosis of early advanced breast cancer patients after adjuvant anthracycline-based chemotherapy〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2014;140(12):2009-19.

9 Irini T,Paraskevi A,Ioanna G,etal.Preserved Axin expression is associated with an aggressive phenotype in invasive breast carcinomas〔J〕.APMIS,2013;121(9):797-805.

10Nair R,Roden DL,Teo WS,etal.c-Myc and Her2 cooperate to drive a stem-like phenotype with poor prognosis in breast cancer〔J〕.Oncogene,2014;33(30):3992-4002.

〔2015-12-31修回〕

(编辑袁左鸣)

齐齐哈尔市科技局指令性科研项目

李春旭(1965-)，男，副主任医师，主要从事肾脏病、乳腺病及妇产科疾病研究。

李春艳(1976-)，女，副主任医师，主要从事乳腺病理研究。

R737.9

A

1005-9202(2016)16-3988-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.16.054

1齐齐哈尔医学院