一株貂源绿脓杆菌的分离和鉴定

杨朋欣，丁国杰，刘可姝，张春媛，王彬

（哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

一株貂源绿脓杆菌的分离和鉴定

杨朋欣，丁国杰，刘可姝，张春媛，王彬

（哈药集团生物疫苗有限公司黑龙江哈尔滨150069）

为鉴定一株引起水貂发病的致病菌，本研究从患病水貂肺脏中分离获得一株优势菌，分别对该分离株进行形态、生化和培养特性研究；分子生物学和血清型鉴定；半数致死量测定。结果表明，该分离株为血清G型水貂源绿脓杆菌；分离株16S rRNA基因序列与已知的绿脓杆菌相应序列同源性为99.16%；分离菌对小鼠的半数致死量（LD50）为1.17×106CFU，对水貂的LD50为1.5×108CFU。

绿脓杆菌；分离鉴定；LD50；水貂

水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌又称铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）感染引起的一种高度致死性传染病，多发于每年9-11月份，该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播［1］。发病急、死亡快，所以又称铜绿假单胞菌肺炎，以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征，死后典型症状为口鼻流出血样泡沫，剖检肺脏呈弥漫性出血。本研究无菌采集多份发病水貂病料肺脏样品，分离出一株细菌。对该分离菌株进行形态、生化和培养特性研究，分子生物学和血清型鉴定等方面的综合分析鉴定，并测定分离菌的半数致死量，为水貂养殖中防治该病提供了理论依据。

1　材料和方法

1.1病料来源

从大连某貂场疑似出血性肺炎的病死水貂无菌采集肺脏3份。

1.2主要试剂

绿脓杆菌分型用标准血清系列，购自日本生研株式会社；绿脓素测定用培养基（PDP）购自北京陆桥公司（PDP）；rTaq、dNTP和DL2000DNAMarker均购自宝生物工程（大连）有限公司；琼脂糖购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.3试验动物

18～20g昆明小鼠购自哈药集团三精制药有限公司；2～5月龄水貂购自尚志五仁养貂专业合作社（绿脓杆菌B型、C型和G型玻片凝集试验抗体阴性）。

1.4分离株的分离培养

分别无菌沾取病料切面划线接种2%牛血清肉汤琼脂平板，37℃过夜培养。挑取疑似阳性菌落接种5mL2%牛血清肉汤培养基，37℃培养过夜，标记为F0代。

1.5分离株形态、生化特性及培养特性

对疑似阳性分离株做进一步的鉴定，取F0代划线培养的典型菌落，分别接种2%牛血清肉汤培养基、PDP斜面和绵羊鲜血琼脂平板；进行革兰氏染色；氧化酶试验。

1.6分子生物学和血清型鉴定

1.6.1分子生物学鉴定将分离纯化的细菌接种于2%牛血清肉汤培养基中培养过夜，煮沸法提取分离菌株的基因组DNA。以绿脓杆菌16SrRNA（GenBank登录号为NR_118644.1）设计引物，上游引物为 5'-GGGGGATCTTCGGACCTC-3'；下游引物为5'-TCCTTAGAGTGCCCACCC-3'，引物由上海生物工程有限公司合成，目的片段大小为956bp。反应体系 为25 μL：Buffer2.5μL、dNTP2μL、上下游引物各1μL、模板1μL、rTaq0.5μL、去离子水补齐。程序为95℃5min；95℃1min、55℃1min、72℃1min，循环35次；72℃10min。进行1%的琼脂糖凝胶电泳。同时，PCR产物送测序。

1.6.2血清型鉴定用绿脓杆菌分型用标准血清进行血清型检测，进一步筛选不同血清型的绿脓杆菌。操作步骤按说明书进行即可。混感病料不做进一步筛选。

1.7分离株的半数致死量试验

1.7.1分离株对小鼠的半数致死量试验对小鼠进行半数致死量（LD50）的测定，选取健康昆明系小鼠40只，分成4组，每组10只，取10-1～10-4滴度的菌液，滴鼻接种0.1mL/只，观察7d，记录各组小鼠死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50

1.7.2分离株对水貂的半数致死量试验对水貂进行LD50测定，选取健康水貂20只，分成4组，分离株菌液进行10倍倍比稀释，选取原倍至10-3滴度，滴鼻接种水貂，0.2mL/只，观察7d，记录各组水貂的死亡情况，按Reed-Muench法计算LD50。

2　结果

2.1分离株的分离培养

对三份病料中的致病菌分别分离培养，仅一份病料初步分离出疑似阳性菌。

2.2形态、生化特性及培养特性

对分离株进行培养，结果表明，该分离株符合绿脓杆菌的形态、生化及培养特性，在2%牛血清肉汤琼脂平板上生长形态正常，革兰氏染色为阴性杆菌；氧化酶试验为阳性；2%牛血清肉汤培养基呈黄绿色浑浊、10%牛血清肉汤琼脂平板成黄绿色，菌落形态正常，在绵羊鲜血琼脂培养基上生长菌落周围出现溶血环，PDP斜面上生长，产绿色素，菌落周围呈浅绿色。

2.3PCR鉴定及序列分析

以提取的分离株的DNA为模板，在1000bp处扩增出1条片段，与预期结果相符，表明该分离株为16SrDNA基因阳性；测序结果预期相符，片段大小为956bp，与 GenBank登（录号为NR_118644.1）16S rDNA 同源性为99.16%。

2.4血清型鉴定

血清型鉴定结果为，生理盐水空白对照组不凝集，血清G型凝集，为血清G型阳性。

2.5分离株半数致死量的测定结果

分离株对小鼠的 LD50为1.17×106CFU，结果（见表1）；分离株对2～5月龄水貂LD50为1.5×108CFU，结果（见表2）。

3　结论与讨论

本研究从疑似出血性肺炎水貂肺脏中分离一株血清G型绿脓杆菌，我国于上世纪80年代初首次报道了水貂出血性肺炎病例，此后相继有该病报道，调查发现我国各地水貂出血性肺炎以G型为主，其次是B型和C型。G型菌株流行情况为60%～80%不等，由于各血清型之间无交叉保护，因此制备的单苗具有可针性［2，3］。

本研究病料分离率偏低，分析原因可能与病料运输与保存有关，提示病料采集后应尽快进行分离；白雪等对2011年分离出的2株G型貂源绿脓杆菌进行LD50测定，结果为对水貂的LD50分别为 2×106CFU和 5×106CFU，对小鼠的 LD50分别为3.38×106CFU和8×106CFU［4］，对水貂的毒力高于本实验1.5× 108CFU的结果，对小鼠的毒力低于本实验1.17×106，这与计算、攻毒方法以及分离株来源等均具有一定的关系。■（编辑：赵晓松）

表1　分离株对小鼠LD50结果

表2　分离株对2～5月龄水貂LD50结果

［1］ 陆承平.兽医微生物学［M］.3版.北京:中国农业出版社，2002:274-275.

［2］ 戴秀美，张永兵，惠涌泉，等.水貂源绿脓杆菌的分离鉴定及致病性试验［J］.动物医学进展，2014，35（8）:126-129.

［3］ 刘德福，赵燕，刘超.水貂暴发出血性肺炎的诊治报告 ［J］.畜牧兽医杂志，2003，22（4）:47-48.

［4］ 白雪，柴秀丽，闫喜军.水貂出血性肺炎流行病学调查及铜绿假单胞菌疫苗研究进展［J］.现代农业科技，2011（15）: 317-318.

Isolation and Identification ofPseudomonasAeruginpsa From theMinks

Yang Peng-xin，Liu Ke-shu，Zhang Chun-yuan，W ang Bin
（Harbin pharmaceutical group bio-vaccine Co.，Ltd.，Harbin HeiLongjiang 150069）

To identify abacterium isolation from themink，the isolatewas investigated through themorphology，biochemical character，cultural character，molecular biology，serotype identification，and LD50test.The results showed that Pseudomonas aeruginosa（P.aeruginosa）type G was isolated from the lung of a dead mink from Dalian of Liaoning Province.The isolate had 99.16%similaritywith P.aeruginosabased on 16SrRNA sequence. The results of LD50testwas 1.17×106CFU formice and 1.5×108CFU formink by using the Reed-Muench calaulationmethod.

Pseudomonasaeruginpsa；Isolation and identification；LD50test；Minks

10.3969/j.issn.1008-4754.2016.9.047