山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响

于林楠+翟宏颖

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用MTT法检测山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响。结果：不同浓度的山慈菇提取物对HT29细胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈时间、剂量依赖关系；山慈菇提取物干预后诱导HT29细胞凋亡（P<0.01）差异有统计学意义；山慈菇提取物诱导细胞凋亡过程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达明显减弱（P<0.05）。结论：山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用，其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。

【关键词】 山慈菇提取物；结肠癌HT29细胞；凋亡

【中图分类号】R282.71 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率逐年增高，随着手术、放疗、化疗等的进步，早中期结肠癌治疗效果明显提高，但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。目前，越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究，从中寻找可以防治肿瘤的有效成分，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点[1-2]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎，具有解毒、化痰、散结等功效，临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗，其中包括结直肠癌[3]。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血系统等作用，但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明[4]。研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响，以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 细胞培养箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式细胞仪6HT2L（美国Guava Easy Cyte公司）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台VD1320（哈尔滨东联技术开发有限公司）；高速冷冻离心机CR21（日本Hitachi公司）；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000（美国Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培养液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亚砜、MTT（DMSO，美国Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人结肠癌细胞HT29的培养 将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用MTT法检测山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响。结果：不同浓度的山慈菇提取物对HT29细胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈时间、剂量依赖关系；山慈菇提取物干预后诱导HT29细胞凋亡（P<0.01）差异有统计学意义；山慈菇提取物诱导细胞凋亡过程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达明显减弱（P<0.05）。结论：山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用，其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。

【关键词】 山慈菇提取物；结肠癌HT29细胞；凋亡

【中图分类号】R282.71 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率逐年增高，随着手术、放疗、化疗等的进步，早中期结肠癌治疗效果明显提高，但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。目前，越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究，从中寻找可以防治肿瘤的有效成分，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点[1-2]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎，具有解毒、化痰、散结等功效，临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗，其中包括结直肠癌[3]。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血系统等作用，但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明[4]。研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响，以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 细胞培养箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式细胞仪6HT2L（美国Guava Easy Cyte公司）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台VD1320（哈尔滨东联技术开发有限公司）；高速冷冻离心机CR21（日本Hitachi公司）；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000（美国Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培养液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亚砜、MTT（DMSO，美国Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人结肠癌细胞HT29的培养 将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。

【摘要】 目的：研究山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用MTT法检测山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞抑制率；流式细胞仪检测细胞凋亡率；Western blot法检测细胞凋亡相关蛋白Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3的影响。结果：不同浓度的山慈菇提取物对HT29细胞增殖均有抑制作用，且抑制率呈时间、剂量依赖关系；山慈菇提取物干预后诱导HT29细胞凋亡（P<0.01）差异有统计学意义；山慈菇提取物诱导细胞凋亡过程中的Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达明显增强，Bcl-2蛋白表达明显减弱（P<0.05）。结论：山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞有明显的促凋亡作用，其机制可能与上调Cyt-C、Bax、Caspase-3下调Bcl-2蛋白的表达有关。

【关键词】 山慈菇提取物；结肠癌HT29细胞；凋亡

【中图分类号】R282.71 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）16-0017-03

Abstract：Objective To investigate the effects of Cremastra appendiculata extract on proliferation and apoptosis in human colon cancer HT29 cells.Methods Using the MTT assay to determine the cell inhibition rates on human colon cancer HT29 cells；the flow cytometry to determine the apoptosis rates；Western blot technology to determine the expressions of Cyt-C、Bcl-2、Bax and Caspase-3 protein.Results Cremastra appendiculata extract inhibited the human colon cancer HT29 cells in a time dependent and dose dependent manner. the apoptosis rates of the cells were increased after being cultured by Cremastra appendiculata extract； the expressions of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein were increased and the expression of Bcl-2 protein was decreased（P<0.05）.Conclusions Cremastra appendiculata extract can induce the apoptosis of HT29 cells by a mechanism that may be related to increase the expression of Cyt-C、Bax and Caspase-3 protein as well as decrease the expression of Bcl-2 protein.

Keywords：Cremastra Appendiculata Extract；Human Colon Cancer HT29 Cells；Apoptosis

结肠癌是消化系统常见恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率逐年增高，随着手术、放疗、化疗等的进步，早中期结肠癌治疗效果明显提高，但对于中晚期、高龄及难手术患者缺少有效的治疗方法。目前，越来越多的医务科研工作者将目光投向天然动植物的研究，从中寻找可以防治肿瘤的有效成分，日渐成为临床抗肿瘤药物研究的热点[1-2]。山慈菇是常用的抗肿瘤中药之一，为兰科植物中杜鹃兰、独蒜兰及云南独蒜兰的干燥假鳞茎，具有解毒、化痰、散结等功效，临床上常以配伍用药的形式应用于各种肿瘤的治疗，其中包括结直肠癌[3]。现代药理研究表明，山慈菇具有抗肿瘤细胞生长、抑制血管生成、抗炎以及影响造血系统等作用，但其抗肿瘤的作用机制尚未完全阐明[4]。研究拟探讨山慈菇提取物对结肠癌HT29细胞凋亡的影响，以期为山慈菇运用于结肠癌的治疗提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 细胞培养箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式细胞仪6HT2L（美国Guava Easy Cyte公司）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台VD1320（哈尔滨东联技术开发有限公司）；高速冷冻离心机CR21（日本Hitachi公司）；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000（美国Bio-Rad公司）。

1.2 材料 山慈菇提取物（沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培养液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亚砜、MTT（DMSO，美国Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 人结肠癌细胞HT29的培养 将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。