福辛普利对糖尿病大鼠心肌骨形态发生蛋白-7表达的影响

司芹芹，李俊岩，宋琪

（长治医学院附属和济医院内分泌科，山西长治046000）

福辛普利对糖尿病大鼠心肌骨形态发生蛋白-7表达的影响

司芹芹，李俊岩，宋琪

（长治医学院附属和济医院内分泌科，山西长治046000）

目的观察骨形态发生蛋白-7在糖尿病大鼠心肌中的表达变化及福辛普利的干预效果。方法将30只Wistar大鼠随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=22），模型组以腹腔注射60 mg/kg链脲佐菌素复制糖尿病大鼠模型。20只大鼠造模成功后随机分为糖尿病对照组（n=10）和福辛普利组（n=10）。福辛普利组给予福辛普利10mg/kg灌胃，空白对照组和糖尿病对照组给予相同体积的生理盐水灌胃，1次/d。用HE、电镜观察心肌变化，Masson染色检测心肌组织中胶原纤维含量的变化，SP免疫组织化学法检测心肌间质中转化生长因子β1、骨形态发生蛋白-7的表达。结果模型组血糖高于空白对照组（t=22.32，P=0.000），体重低于空白对照组（t=13.32，P=0.000），心脏指数高于空白对照组（t=5.32，P=0.021），糖尿病对照组和福辛普利组之间差异无统计学意义（t=1.32，P=0.520）。与空白对照组比较，糖尿病对照组和福辛普利组的胶原含量增多（t=2.32，P=0.001）；与糖尿病对照组比较，福辛普利组的胶原含量降低（t=4.32，P=0.011），与空白对照组比较，糖尿病对照组和福辛普利组的转化生长因子β1含量增多（t=12.32，P=0.021），与糖尿病对照组比较，福辛普利组的转化生长因子β1含量降低（t=22.32，P=0.012）。骨形态发生蛋白-7的表达的变化：与空白对照组比较，糖尿病对照组和福辛普利组的骨形态发生蛋白-7含量减少（t=15.21，P=0.022），与糖尿病对照组比较，福辛普利组的骨形态发生蛋白-7增多（t=29.21，P=0.000）。结论在链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠模型中，心脏指数、心肌间质胶原、转化生长因子β1的表达较空白对照组增加，而骨形态发生蛋白-7表达减少，福辛普利能抑制该效应；提示福辛普利可能通过抑制转化生长因子β1的表达，增加骨形态发生蛋白-7的表达，在一定程度上抑制心肌纤维化的发展。

糖尿病大鼠；心肌纤维化；骨形态发生蛋白-7；转化生长因子β1；福辛普利

血管紧张素转化酶抑制剂（angiotension converting enzyme inhibitor，ACEI）类药物是目前公认的可逆转心室重构药物，其作用主要是通过抑制血管紧张素转化酶从而减少血管紧张素Ⅱ（AngiotensionⅡ，AngⅡ）的含量，抑制成纤维细胞的增殖和胶原酶的活性，可在一定程度上改善心肌纤维化和心肌肥厚[1-3]。目前，已有研究证实了ACEI可通过减少AngⅡ而间接减少心肌中转化生长因子β1（transforming growth factor beta-1，TGF-β1）的表达，在肾纤维化中ACEI还可通过抑制TGF-β1的表达增加骨形态发生蛋白-7（bone morphogenetic protein-7，BMP-7）及其下游Ⅰ型受体和Ⅱ型受体的表达以减轻肾纤维化[4-6]。目前有关BMP-7在糖尿病心肌纤维化中的研究甚少，亦无ACEI类药物在抑制糖尿病心肌纤维化方面的报道。鉴此，笔者推测在糖尿病心肌病中存在BMP-7的表达并初步用ACEI类药物干预，以探讨ACEI类药物在减轻心肌间质重塑的同时能否影响到BMP7的表达。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂链脲佐菌素（美国Sigma公司），福辛普利钠片（中美上海施贵宝制药有限公司），苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HE）试剂盒，DAB显色试剂盒（河南博士德生物工程公司），Masson染色试剂盒（福州迈新生物技术开发公司），免疫组织化学SP试剂盒（武汉艾美捷科技有限公司），兔抗鼠BMP-7多克隆抗体、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗体（Bioworld公司），4%多聚甲醛（河南大学医学院中心实验室）。

1.1.2仪器血糖试纸、血糖仪（德国拜耳公司），电子分析天平（中国大华仪表厂），光学显微镜、电子显微镜及显微镜摄像系统Olympus BX50（日本Olympus公司），切片机（青海金诃藏药公司），生物组织自动脱水机（湖北省医疗仪器厂），Microfuge 22R离心机（德国BECKMAN公司）。

1.1.3实验动物雄性Wistar大鼠30只，体重（225±26）g，购自湖北省疾病预防控制中心（证书编号：Scxk 2008-0005；SPF级别）。实验大鼠分组（4只一笼）饲养于标准实验房，（22±2）℃，予以规律光照（昼夜各12h），常规予标准饲料喂养，给予大鼠自由饮食饮水。

1.2方法

糖尿病动物模型的复制：将30只Wistar大鼠随机分为空白对照组（n=8）和模型组（n=22）。适应性喂养1周后，禁食12h，模型组大鼠给予腹腔内注射链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）60 mg/kg（以pH 4.2的柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液溶解，配制成1%的STZ溶液），空白对照组大鼠注射等量柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液（pH 4.2）。继续原饲料喂养，每天记录进食量及饮水量，3d后，禁食12h，鼠尾取静脉血测定空腹血糖1次。糖尿病大鼠成模的诊断标准为：空腹血糖≥16.7mmol/L，未达成模标准者剔除。

造模后大鼠分组及药物干预办法：将20只造模成功后大鼠（死亡0只，2只未成功）随机分为糖尿病对照组（n=10）和福辛普利组（n=10）。福辛普利组给予福辛普利（10 mg/kg）灌胃，空白对照组、糖尿病对照组给予相同体积的生理盐水灌胃，1次/d。每周检测1次随机血糖。

动物取材，心重的测定：给药6周后，术前禁食12 h，每只大鼠称取体重并测量血糖后，1%的戊巴比妥钠按照40 mg/kg体重的标准腹腔注射麻醉，解剖后迅速取出心脏，投入4℃冰磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）中，使离体心脏收缩3～4个心动周期，射出左心室内残余血液，称心脏的重量，然后沿房室交界处去除左右心房及大血管，去除右心室游离壁，吸水纸吸干残余水分，称左心室（含室间隔LVW）重量。取部分左室心肌10%甲醛固定。部分液氮保存。

心肌组织形态学观察：取4%多聚甲醛固定好的心肌组织于左室游离壁处取样，石蜡包埋，常规HE染色。光镜下观察心肌细胞及心肌间质的变化，并摄片留用对比。

心肌Masson三色染色：将组织切片苏木素染色5 min，95%的乙醇洗2次，苦味酸乙醇液分色，流水冲洗，蒸馏水冲洗，丽春红酸性复红液中染色5 min，蒸馏水冲洗，1%磷钼酸染色5 min，醋酸苯胺蓝染色1 min，1%醋酸处理1 min，脱水、透明、封片固定。光镜下观察心肌细胞、胶原形态并拍片。扫描入计算机，图像分析仪定量心肌组织胶原含量。

心肌免疫组织化学染色检测TGF-β1、BMP-7：显微镜观察，阳性结果为细胞浆呈棕黄色颗粒。免疫组织化学阳性表达率越高，光密度值越大。用已知的阳性切片同时同一条件下染色作阳性对照，用PBS代替一抗作阴性对照，染色结束后每张切片随机选取5个视野，Olympus BX50显微镜摄像系统摄像，采用高清晰彩色图文报告分析系统分析，以5个视野的光密度值的平均值作为各标本的蛋白表达。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间均数的比较，用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1血糖、体重、心脏指数的比较

糖尿病对照组和福辛普利组大鼠各死亡2只，死亡原因可能为酮症酸中毒或者感染。空白对照组、糖尿病对照组和福辛普利组的体重、心脏指数、血糖经方差分析，差异有统计学意义（F=44.476、128.457和35.655，P=0.000）。与空白对照组比较，经LSD检验，糖尿病对照组的体重、心脏指数、血糖差异有统计学意义（t=13.32、5.322和2.32，P=0.000、0.021和0.000），糖尿病对照组体重低于空白对照组，心脏指数、血糖高于空白对照组。糖尿病对照组和福辛普利的体重、心脏指数、血糖比较经LSD检验，差异无统计学意义（t=1.32，P=0.052）。见表1。

表13　组大鼠体重、心脏指数和血糖的比较（±s）

注：†与空白对照组比较，P<0.05

g心脏指数/（mg/g）血糖/（mmol/L）空白对照组（n=10）317.00±16.002.74±0.405.04±1.16糖尿病对照组（n=8）296.00±8.20†3.34±0.29†24.56±3.22†福辛普利组（n=8）272.00±11.20†3.37±0.25†22.02±2.61†F值44.476128.45735.655 P值0.0000.0000.000组别体重/

2.2心肌组织病理及结构变化

2.2.1光镜观察空白对照组：心肌纤维走行正常，排列整齐、致密，结构清晰，心肌细胞核呈圆形或椭圆形，在细胞中央，细胞外间质较少，间质及微血管正常。糖尿病对照组：大鼠心肌纤维走行较为紊乱，出现核裂解以及核丢失现象，心肌细胞变性，心肌细胞肥大，扭曲，细胞间质界限不清。福辛普利组：心肌纤维表现介于两者之间，可见心肌细胞水肿，少量纤维细胞增生，血管内膜增生，组织充血，肌纤维排列较稀疏，少量纤维组织变性。见图1。

图1　心肌组织HE染色

2.2.2电镜观察空白对照组：心肌肌原纤维结构清晰，肌丝排列整齐，各带明显，细胞核发育良好，线粒体结构完好呈圆形或椭圆形，嵴规则，无肿胀、变性等，线粒体及肌丝间糖原颗粒丰富正常，相邻心肌纤维处可见闰盘连接，心肌纤维间可见许多微血管，毛细血管基底膜无增厚。糖尿病对照组：心肌肌原纤维走行紊乱，肌节破坏断裂，长短不一，肌丝灶性溶解、消失，闰盘排列有断裂现象，线粒体明显增多，大小不一，形态各异，部分线粒体肿大，嵴断裂溶解，呈絮状、水鞘图样及空泡样变，可见大量糖原聚集，肌原纤维间可见成束的胶原结缔组织，成纤维细胞增生活跃，心肌内微血管基底膜增厚，内皮细胞肌膜断裂，核染色体边集，可见内皮细胞凋亡。肌原纤维间散在大量的脂滴及脂褐素。福辛普利组：心肌肌原纤维大都排列整齐，肌节发育良好，明暗带分明，闰盘排列紧密，核周大量丰富的发育良好的线粒体，肌丝及线粒体间糖元颗粒较丰富，肌细胞间未见明显胶原增生。见图2。

图2　电镜下心肌组织的超微结构

2.3心肌间质胶原纤维含量变化

Masson染色可见空白对照组心肌间质少量胶原纤维均匀分布，糖尿病心肌间质胶原纤维和血管周围胶原纤维被染成蓝色，心肌被染成红色，胶原纤维明显增加。经治疗后心肌间质和血管周围胶原纤维增生受到一定程度抑制。见图3。

图3　心肌组织Masson染色

空白对照组、糖尿病对照组和福辛普利组的心肌间质及血管周围胶原容积分数经方差分析，差异有统计学意义（F=3.476，P=0.000）。与空白对照组的胶原含量比较，经LSD检验，糖尿病对照组和福辛普利组的胶原含量增多，差异有统计学意义（t= 2.325和2.324，P=0.001和0.002）；与糖尿病对照组的胶原含量比较，福辛普利组的胶原含量降低，差异有统计学意义（t=4.325，P=0.011）。见表2。

表2　各组大鼠心肌间质及血管周围胶原容积分数（±s）

表2　各组大鼠心肌间质及血管周围胶原容积分数（±s）

注：1）与空白对照组比较，P<0.01；2）与糖尿病对照组比较，P< 0.05

组别心肌间质及血管周围胶原容积分数空白对照组（n=10）0.1374±0.0017糖尿病对照组（n=8）0.2355±0.00161）福辛普利组（n=8）0.1986±0.00341）2）F值3.476 P值0.000

2.4TGF-β1、BMP-7的表达

TGF-β1表达的变化：空白对照组、糖尿病对照组和福辛普利组的TGF-β1相对光密度经方差分析，差异有统计学意义（F=48.576，P=0.000）。与空白对照组比较，经LSD检验，糖尿病对照组和福辛普利组的TGF-β1含量增多，差异有统计学意义（t= 12.324和22.320，P=0.021和0.012），与糖尿病对照组比较，经LSD检验，福辛普利组的TGF-β1含量降低，差异有统计学意义（t=15.234，P=0.020）。

BMP-7的表达变化：空白对照组、糖尿病对照组和福辛普利组的BMP-7相对光密度经方差分析，差异有统计学意义（F=39.653，P=0.000）。与空白对照组比较，经LSD检验，糖尿病对照组和福辛普利组的BMP-7含量减少，差异有统计学意义（t=15.212和29.212，P=0.022和0.000），与糖尿病对照组的BMP-7含量比较，经LSD检验，福辛普利组的BMP-7含量增多，差异有统计学意义（t=29.212，P=0.000）。见图4、5和表3。

图4　心肌组织TGF-β1免疫组织化学染色

图5　心肌组织BMP-7免疫组织化学染色

表3　各组大鼠TGF-β1、BMP7蛋白的表达（±s）

表3　各组大鼠TGF-β1、BMP7蛋白的表达（±s）

注：1）与空白对照组比较，P<0.05；2）与糖尿病对照组比较，P< 0.05；3）与空白对照组比较，P<0.01；4）与糖尿病对照组比较，P<0.01

组别TGF-β1相对光密度BMP-7相对光密度空白对照组（n=10）0.0716±0.00390.2127±0.0293糖尿病对照组（n=8）0.2644±0.02631）0.0332±0.00311）福辛普利组（n=8）0.1674±0.00691）2）0.0647±0.00603）4）F值48.57639.653 P值0.0000.000

3 讨论

糖尿病性心肌病（dialbetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病患者的心血管并发症之一。临床上可表现为心绞痛、进行性心功能不全，常有房性奔马率和室性奔马率出现，极易发生心力衰竭，检查可发现心脏增大。DCM的病理特点是：心肌细胞肥大、心肌间质纤维化和心肌微小血管广泛内膜病变。DCM发病机制复杂，与代谢因素细胞学病变、心肌细胞间质纤维化和心肌胶原网络重构等因素有关。大量研究表明，DCM发生，可能与多种细胞因子如TGF-β1、内皮素、血管紧张素Ⅱ等参与DCM的发生、发展有关[1-2]。研究表明，DCM的发生与心肌局部RAS活性增高和TGF-β1表达增加有关。TGF-β1可影响心肌成纤维母细胞活性，参与胶原合成的调节，而在DCM的发生、发展中起到重要作用。而BMP-7能拮抗TGF-β1作用而延缓间质纤维化。研究证实，血管紧张素Ⅱ引起心脏肥大的可能机制是诱导TGF-β1的合成和表达增加[7]。研究证实，AngⅡ和TGF-β1在功能上是密切相关，在心肌纤维化病程中，AngⅡ增加TGF-β1基因的表达，而TGF-β1也可以调节AngⅡ水平。

ACEI可作用于血管紧张素Ⅰ转化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）而使其不能将AngⅠ转化为AngⅡ，继而使RAS激活时所出现的病理反应过程受到抑制[7-8]。福辛普利是目前常用的一种长效ACEI制剂，它在体内吸收后水解成具有ACEI作用的活性成分福辛普利拉，后者通过竞争性抑制ACE的活性，减少有强烈缩血管作用的AngⅡ，从而舒张血管，改善心肌代谢，同时可阻断由RAS激活所介导的成纤维细胞活性增加的连锁反应。

本实验采用Masson三色染色对心肌组织进行染色，其中胶原纤维被染上蓝色，肌纤维则被染上红色。研究发现，6周时糖尿病大鼠的体重下降，心脏指数高于正常大鼠，胶原纤维的含量也增加。应用福辛普利治疗后糖尿病大鼠心肌组织中胶原纤维的含量相对于未予福辛普利组减少[9]。由此可见，在糖尿病大鼠心肌中存在间质重构，且福辛普利可以逆转糖尿病心肌间质重构[10]。但是福辛普利组与糖尿病对照组相比，心脏指数差异无统计学意义，可能与病程和治疗时间有关。目前大量研究表明，糖尿病状态下，由于高糖、氧化应激、血管紧张素Ⅱ、糖基化终产物等可导致TGF-β1的活化，从而激活其下游的TGF-β1/SMAD通路，使得糖尿病大鼠心肌组织中TGF-β1的表达增多。如研究表明高糖环境下可以诱导TGF-β1的表达增加和其下游的Ⅱ型受体的表达增加[11]。本研究亦发现，在糖尿病大鼠心肌中TGF-β1的表达明显高于空白正常对照组，实验结果与文献报道相一致[12]。其原因可能是因为高糖通过血管紧张素2型受体刺激心肌细胞中TGF-β1的分泌，使TGF-β1表达增多[13]。本实验也发现糖尿病大鼠心肌间质胶原纤维含量明显增多。

糖尿病心肌纤维化的过程与很多细胞和分子的参与密切相关，各种因素之间相互作用，机制非常复杂[14-15]。本研究笔者在糖尿病动物模型身上观察到BMP-7蛋白的变化与心肌纤维化的变化相反，二者之间可能存在着一定的联系，需要进一步研究确定。本研究初步探讨BMP-7缺失在心肌纤维化方面的重要作用，为今后的药物开发和临床应用提供依据。

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（申海菊编辑）

Effect of Fosinopril on expression of bone morphogenetic protein 7 in myocardium of diabetic rats

Qin-qin Si，Jun-yan Li，Qi Song
（Department of Endocrinology，the Affiliated Heji Hospital of Changzhi Medical College，Changzhi，Shanxi 046000，China）

Objective To investigate the effect of Fosinopril on the expression of bone morphogenetic protein 7（BMP7）in myocardium of diabetic rats and to understand the role ofBMP7 in myocardial fibrosis of diabetic rats.Methods Thirty male Wistar rats weighting 200-250 kg were randomly divided into normal control group（n=8）and model group（n=22）.Among them，the rats in model group were injected with Streptozotocin（STZ）at a dose of 60 mg/kg body weight.If the blood sugar was 16.7 mmol/L or above，the diabetic model was established.In the end，the 20 successful diabetic rats were randomly divided into diabetic control group（n=10）and Fosinopril group（n=10）.The rats in the Fosinopril group were given Fosinopril sodium tablets at a dose of 10 mg/kg once a day，those in the normal and diabetic control groups were administratedwith the same volume of sodium chloride once a day.The blood sugar was measured in each rat every two weeks.After six weeks，all the rats were anesthetized to death.The body weight and heart were measured，and the cardiac index（heart weight/body weight）were calculated.The changes of myocardial structure were observed by HE staining and electron microscopy.The change in the content of collagen fiber was measured by Masson staining.The expressions of BMP7 and TGF-β1 were detected using immunohistochemical technique.Results Blood sugar and cardiac index in the model group increased obviously（P＜0.05），while body weight decreased significantly compared to the normal control group（P＜0.05）；but there were no significant differences between the diabetic control group and the Fosinopril group.Compared with the normal group，the content of TGF-β1 and collagen fiber increased significantly in the model group（P＜0.05）.Compared with the diabetic control group，the content of TGF-β1 and collage fiber decreased significantly in the Fosinopril group（P＜0.05）.Compared with the normal control group，the content of BMP7 decreased significantly in the model group（P＜0.05）.Compared with the diabetic control group，the content of BMP7 increased significantly in the Fosinopril group（P＜0.01）.Conclusions Fosinopril can inhibit the development of myocardium fibrosis by increasing the expression of BMP7.

diabetic rat；myocardial fibrosis；bone morphogenetic protein 7；transforming growth factor beta-1；Fosinopril

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.17.002

1005-8982（2016）17-0007-06

2015-07-10