多重耐药鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的检测及耐药分析

董春忠， 孙 霞， 郑媛媛， 朱元祺

·论著·

多重耐药鲍曼不动杆菌中16S rRNA甲基化酶基因的检测及耐药分析

董春忠1， 孙 霞2， 郑媛媛1， 朱元祺3

目的 了解医院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌16S rRNA甲基化酶基因分布情况，为临床合理应用抗菌药物提供依据。方法 采用Phoenix100微生物全自动鉴定系统进行菌株鉴定及药敏试验；采用PCR方法检测armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。结果 46株鲍曼不动杆菌中armA基因阳性36株，阳性率78.3 %，未检出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。药敏试验结果显示医院分离的多重耐药鲍曼不动杆菌对多黏菌素全部敏感，对四环素、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率分别为13.0 %、80.4 %、91.3 %、95.7 %、95.7 %，对其他测试药物耐药率100 %。结论 医院分离鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药性已非常严重，携带armA基因是导致氨基糖苷类耐药的原因之一，延缓鲍曼不动杆菌多重耐药性已刻不容缓。

多重耐药鲍曼不动杆菌； 16S rRNA甲基化酶； armA基因

多重耐药鲍曼不动杆菌（multidrug resistant A.baumannii，MDRAB）是指对头孢菌素、碳青霉烯类、β内酰胺酶抑制剂复合制剂、氟喹诺酮类、氨基糖苷类抗菌药物中至少3类抗菌药物耐药的菌株［1］。根据2013年CHINET细菌耐药性监测数据，鲍曼不动杆菌临床分离株数居第3位，检出率占11.97 %。对氨基糖苷类阿米卡星、庆大霉素耐药率分别为46 %、63.3 %［2］。armA甲基化酶基因几乎可导致细菌对所有氨基糖苷类耐药，了解医院分离的MDRAB中16S rRNA甲基化酶armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因分布情况，为临床合理应用抗菌药物提供依据。现将研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 收集医院2013年8－11月分离的非重复碳青霉烯类耐药鲍曼不动杆菌46株。分离自住院患者送检的痰液34株、创面分泌物4株、脓液6株和胸水2株。其中科室分布为内科ICU 25株、神经外科10株、呼吸科8株、烧伤科2株和干部保健科1株。

1.1.2 仪器与试剂 采用PhoenixSpec比浊仪制备特定浓度菌悬液；采用Phoenix100微生物全自动鉴定系统进行菌株鉴定；革兰阴性菌鉴定药敏复合板、鉴定培养液、药敏培养液、药敏指示剂均由美国BD公司生产；妥布霉素E试验条由法国梅里埃公司生产；PCR反应试剂由TaKaRa大连公司生产；PCR纯化试剂由美国Axygen公司生产；ABI-Veriti梯度PCR仪、3700x1DNA基因测序仪为美国ABI公司生产；PCR扩增委托上海生工生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 药敏试验 挑取培养18～24 h纯菌落4～5个，使用鉴定培养液制备成0.5麦氏单位浓度的菌悬液混匀，吸取25 μL加入药敏培养液中，加入药敏指示剂1滴（约50 μL）混匀，以重力加样方式将菌液加到板条中，在电脑中输入板条信息，将板条置入主机中，仪器自动检测并报告结果；药物敏感试验解释标准按CLSI 2012，M100-S22执行，药敏数据采用WHONET5.6软件统计分析。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25922、铜绿假单胞菌ATCC 27853（购自卫生部临检中心）。

1.2.2 耐药基因检测 采用PCR方法检测armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。PCR扩增条件为：95℃预变性7 min，95℃变性30 s，50℃退火1 min，65℃延伸8 min，30个循环，65℃延伸16 min。引物设计参照文献［3-4］。 耐药基因引物序列见表1。

表1 耐药基因引物序列Table1 Primer sequences used in PCR

2 结果

2.1 鲍曼不动杆菌对16种抗菌药物的耐药率

46株鲍曼不动杆菌对多黏菌素全部敏感，对四环素、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、甲氧苄啶-磺胺甲唑耐药率分别为13.0 %、80.4 %、91.3 %、95.7 %、95.7 %，对其他测试药物耐药率100 %。见表2。

表2 46株鲍曼不动杆菌对抗菌药物的耐药率和敏感率Table2 Susceptibility of 46 Acinetobacter baumannii isolates to antimicrobial agents

2.2 PCR检测结果

46株鲍曼不动杆菌中armA基因阳性36株，阳性率78.3 %， armA基因PCR结果见图1。未检出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因。36株armA基因型鲍曼不动杆菌的标本分布是痰液28株、脓液6株、创面分泌物2株。科室分布为ICU 23株、神经外科6株、呼吸科3株、烧伤科1株、心胸外科1株、肝胆外科1株、肾内科1株。

图1 鲍曼不动杆菌armA基因PCR结果Figure 1 PCR amplification of armA gene for Acinetobacter baumannii

3 讨论

鲍曼不动杆菌为革兰阴性球杆菌，单个或成对排列，有时呈丝状或链状。氧化酶阴性、动力阴性、硝酸盐阴性，生化反应典型“三阴”区别于其他不发酵糖革兰阴性杆菌。鲍曼不动杆菌具有长期在体外生存的能力，随着抗菌药物广泛使用、侵袭性操作的增多、接受机械通气、长期入住ICU、免疫抑制剂的使用等均可导致鲍曼不动杆菌的感染。鲍曼不动杆菌具有获得性耐药和克隆播散的能力，多重耐药、广泛耐药、全耐药鲍曼不动杆菌呈世界性流行［5］，由多重耐药到广泛耐药再到全耐药仅用了10年时间［6］。

16S rRNA甲基化酶作为介导高水平氨基糖苷类抗菌药物耐药的一类酶［7］， 引起常用氨基糖苷类高水平耐药［8］。文献证实armA基因分离于鲍曼不动杆菌中，rmtB 基因分离于肠杆菌科细菌中［9］。梁彩倩等［10］在肺炎克雷伯菌中armA、rmtB基因检出率为11.1 %、6.2 %。在鲍曼不动杆菌中仅检测到armA基因，该类耐药决定因子常与其他耐药基因共同存在于质粒、转座子等移动元件上，在不同菌株间广泛播散，导致细菌出现多重耐药［11］。本研究发现医院分离的MDRAB armA阳性率78.3 %。高于奚俊等［12］55.5 %、王英田等［13］60 %的报道；与李玉珍等［4］74.1 %的报道接近；与冯旰珠等［14］报道未检出16S rRNA甲基化酶armA基因不一致。可能与菌株研究时间、地域有关。我们未检出rmtA、rmtB、rmtC、rmtD基因与诸多文献一致［4，12-13］。药敏试验结果显示医院分离的MDRAB对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素耐药率分别为80.4 %、91.3 %、95.7 %。可见医院鲍曼不动杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药性已非常严重，携带armA基因是导致氨基糖苷类耐药的原因之一。采取相应措施延缓鲍曼不动杆菌多重耐药性已刻不容缓。

为此医院制订了鲍曼不动杆菌治疗方案、合理处方方案、监测抗菌药物使用率等，同时联合感染科、院感管理部门、微生物室、临床药学部门对细菌耐药性增加的趋势进行干预。希望能延缓鲍曼不动杆菌多重耐药性的迅速发展。

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Detection of 16S rRNA methylase gene in multiple drug resistant Acinetobacter baumannii and associated antibiotic resistance

DONG Chunzhong， SUN Xia， ZHENG Yuanyuan， ZHU Yuanqi.
（Department of Laboratory Medicine， People's Hospital of Binzhou City， Binzhou Shandong 256610， China）

Objective To investigate the prevalence of 16S rRNA methylase gene in the strains of multidrug-resistant Acinetobacter baumannii isolated from patients to provide basis for rational use of antimicrobial agents. Methods Phoenix100 automated microbial identifcation system was used for strain identifcation and antimicrobial susceptibility testing. PCR was used for detection of armA， rmtA， rmtB， rmtC， and rmtD genes. Results The armA gene was positive in 36 （78.3 %） of the 46 strains. All the strains were negative for rmtB， rmtA， rmtC， and rmtD genes. Susceptibility testing showed that the multi-drug resistant A. baumannii strains were susceptible to polymyxin， but various resistance rates to tetracycline （13.0 %）， amikacin （80.4 %）， gentamicin （91.3 %），tobramycin （95.7 %）， and trimethoprim-sulfamethoxazole （95.7 %）， and 100 % resistant to the other antimicrobial agents tested. Conclusions The antibiotic resistance is very serious in Acinetobacter baumannii， especially those carrying armA gene， which confers aminoglycoside resistance. We have no time to waste in containing the multidrug-resistance of Acinetobacter baumannii.

multidrug-resistant Acinetobacter baumannii； 16S rRNA methylase； armA gene

R378

A

1009-7708 （ 2016） 05-0618-04

10.16718/j.1009-7708.2016.05.016

2015-09-30

2015-12-04

山东省科技发展计划项目（2009GG10002057）；青岛经济技术开发区重点科技发展项目（2013-1-82）。

1. 山东省滨州市人民医院检验科，山东滨州 256610；2. 滨州市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心；3.青岛大学附属医院检验科。

董春忠（1975—），男，学士，主管技师，主要从事临床微生物检验工作。

朱元祺，E-mail： zyudot@aliyun.com。