榧树雄球花发育过程中可溶性蛋白的动态变化

2016-10-21卢婷林二培张俊红等

安徽农业科学 2016年4期

卢婷林二培张俊红等

摘要[目的]研究榧树雄球花发育过程中可溶性蛋白的动态变化，以进一步分离与花芽分化相关的特异蛋白。[方法]以榧树雄株花芽及芽基部叶片为材料，测定分析雄球花发育过程中可溶性蛋白含量以及特异蛋白组分的动态变化。[结果]在雄球花发育过程中，花枝叶片的可溶性蛋白存在2个表达高峰，分别在鳞片分化期和二核期花粉粒形成期；而花芽中的可溶性蛋白含量呈现一直下降的趋势。SDSPAGE分析结果也表明，在雄球花发育的不同阶段，在花枝叶片和花芽中均出现了特异的蛋白谱带。[结论]为了解榧树雄球花发育的生理过程和进一步研究香榧成花调控提供了依据。

关键词榧树；雄球花；可溶性蛋白

中图分类号S718.3文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-219-03

The Dynamic Changes of Soluble Proteins during Staminate Strobili Development in Torreya grandis

LU Ting1，2，LIN Erpei1，ZHANG Junhong1，LOU Xiongzhen1* et al （1.School of Forestry and Biotechnology，Zhejiang A&F University，Linan，Zhejiang 311300； 2.Yuyao Municipal Bureau of Agriculture and Forestry Seed Management Station，Yuyao，Zhejiang 315400）

Abstract[Objective] To study the dynamics of soluble protein in development process of Torreya grandis staminate strobili，and further isolate specific proteins related to flower bud differentiation.[Method] With male plant flower bud and bud base leaves as materials，the dynamics of soluble protein content and specific protein components during development were determined and analyzed.[Result] During the development of staminate strobili，there were two expression peaks for the soluble proteins in the leaves，which were shown at the microsporophyll differentiation stage and binuclear pollen stage，respectively； while in staminate strobili，the contents of soluble proteins presented the downward trend.Meanwhile，analysis of the SDSPAGE also indicated that several specific protein components were shown in the leaves and staminate strobili.[Conclusion] The study results can provide reference for understanding the physiological process of Torreya grandis staminate strobili，and further research of flowering regulation of Torreya grandis.

Key wordsTorreya grandis； Staminate strobili； Soluble proteins

香榧（Torreya grandis）屬红豆杉科榧属，是从榧树（T.grandis）的自然变异类型中经无性繁殖培育而成的优良品种，集食用、药用、油用、材用和观赏绿化于一身，栽培经济效益显著，其果实是我国特有的珍稀干果[1-3]。浙江省是我国香榧重要的产区，但香榧营养生长期长，“大小年”现象突出，严重限制其产业的持续发展[4]。从生理角度讲，营养生长期和“大小年”等生产相关的问题均与香榧花芽形成分化有关。因此，开展香榧花芽形成的生理及其调控研究，对于推动当前香榧产业的可持续发展具有重要的现实意义。

多年生木本植物花芽的形成受到复杂的内在因子和环境因素的调控，现有研究表明蛋白质含量的动态变化与植物花芽形成分化有关。何绍兰等[5]以金柑（Fortunella margarita）、椪柑（Citrus reticulata cv.Ponkan）、宫川温州蜜柑（Citrus unshiu cv.Miyagawa Wase）为材料，分析了促、抑花处理对芽体蛋白质动态变化的影响，结果表明在花芽诱导期间，经抑花处理的芽组织中出现新合成的小分子、中性至弱碱性蛋白质，而随着花芽由生理分化向形态分化过渡，环割处理的花芽组织出现小分子酸性特异蛋白质。肖华山等[6]利用电泳技术研究了荔枝雌花芽发育期蛋白质的特异性，发现荔枝雌花在4个不同发育时期，蛋白质合成总体上逐渐增强，大孢子成熟期蛋白质含量最高，且蛋白质具有发育时期的特异性，认为荔枝雌花发育是一个由多基因控制且受环境综合因素影响的极其复杂的生理过程。可见，蛋白质含量的动态变化与多年生木本植物花芽的形成有重要关系。在以往的报道中，多数学者仅对香榧花芽发育过程中芽体形态变化[7]、核酸[8]和内源激素[9]的动态变化作了研究，迄今尚未涉及蛋白质含量变化与香榧花芽发育的关系的研究。该研究以榧树雄花芽分化过程中的叶片和花芽为材料，进行可溶性蛋白质含量测定和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，明确榧树雄花芽发育过程中蛋白质动态变化规律，以期进一步分离与花芽分化相关的特异蛋白，为最终实现调控香榧成花研究提供基础资料。

1材料与方法

1.1材料供试材料为采自浙江省诸暨市赵家镇杜家坑村正常开花的4株成年榧树雄株，树龄30年左右。根据前期的形态观察及香榧花芽發育过程的相关研究[4]，从2012年6月开始分阶段采集样品，相应花芽发育时期见表1。野外采样时，剪取树冠中上部各个方向的花枝，放入冰瓶中带回实验室。在室内通过显微解剖观察选取具代表性的叶片和花芽，立即贮存于超低温冰箱（-80℃）中，备用。

1.2方法

1.2.1可溶性蛋白提取、含量测定。样品可溶性蛋白提取采用TrisHCl提取法，称取0.5 g左右花枝上的叶片或花芽鲜样，加入5 mL 预冷TrisHCl （0.1 mol/L，pH 7.5），冰浴研磨，转入10 mL离心管中，在10 000 g 4 ℃ 条件下离心15 min，取上清液于5 mL离心管中，继续10 000 g 4 ℃条件下离心15 min，取上清液，-20 ℃保存待用。可溶性蛋白含量测定参照考马斯亮蓝G250（Bradford）法，测定均重复3次。

1.2.2可溶性蛋白分离检测。采用垂直板十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）对样品可溶性蛋白溶液进行分离，选择改良式银染对蛋白质条带进行染色，拍照后利用Quantity One图像分析软件进行分析。

2结果与分析

2.1雄球花发育过程中花枝叶片和花芽可溶性蛋白含量的变化由表1可知，在花芽分化过程中，叶内可溶性蛋白含量在不同发育时期呈现不同的动态变化，出现2次峰值，分别为2011年7月28日的8.41 μg/g和2012年4月20日的9.18 μg/g，2次峰值无显著差异。2011年6～7月，叶片可溶性蛋白含量持续上升，在7月28日出现第1个峰值；到8月22日，急剧下降到最低值（4.15 μg/g），这可能是因为该时期雄球花中轴迅速伸长，小孢子叶原基开始分化，分裂旺盛，需要叶片提供大量蛋白；9月份叶片可溶性蛋白含量重新上升，但极显著低于7月份的峰值；进入10月下旬，叶片可溶性蛋白含量又开始下降；到了12月份，叶片可溶性蛋白含量降至整个花芽发育过程的次低值（4.78 μg/g），这可能是由于外界低温影响了叶片可溶性蛋白的合成，同时该时期的雄花芽一直处于四分体时期，芽体活动不旺盛，不需要大量蛋白；2012年3～4月天气转暖后，叶片可溶性蛋白含量开始迅速上升，至4月20日达另1个峰值，这可能是因为外界气温回升，叶片各种生理代谢重新活跃，可溶性蛋白合成加快，而花粉接近成熟，所需蛋白较少。而花芽内的可溶性蛋白含量从2011年10月30日开始一直持续下降，且均低于同时期叶片可溶性蛋白含量，这说明雄球花发育过程所需的蛋白可能主要依赖叶片提供。

2.2雄球花发育过程中可溶性蛋白SDSPAGE检测为了分离与香榧雄球花发育相关的特异蛋白，该研究通过SDSPAGE电泳对叶片和花芽中的可溶性蛋白进行分析。由图1、2可知，在香榧雄球花发育过程中，叶片和花芽中蛋白质谱带有明显差异，某些特定的蛋白质谱带可能与特定的发育时期相关。由图1可知，在鳞片分化期（II1，II2）叶片中出现了53.4和55.2 ku 2个特异谱带，这2个特异条带一直维持到花芽发育的后期，但在小孢子叶分化阶段（III和IV）表达较弱；另1个在鳞片分化期出现的特异谱带65.8 ku则一直较稳定表达。而到了花粉母细胞形成阶段（V），叶片中出现了45.4、58.1和73.5 ku 3个特异条带，58.1 ku条带只在花粉母细胞形成阶段（V）出现，在之后阶段就消失了，但45.4和73.5 ku条带则跨越了整个花芽发育的后期，且有随着花粉成熟其含量呈逐渐升高的趋势。此外，从四分体时期开始，叶片中还出现了另1个特异谱带59.6 ku，该条带主要在花粉成熟的后期（VII～IX）表达。相对叶片，在香榧雄球花发育过程中，花芽中可溶性蛋白的谱带差异不大，在整个四分体时期（VI～VIII）可溶性蛋白的组成成分基本没有变化，可能是因为花芽处于冬季休眠状态，花芽生理活动比较少，可溶性蛋白的组分变化不明显（图2）。但花芽发育过程中，也存在特异的谱带。如在四分体初期出现的57.1和58.5 ku这2个条带，在四分体后期单核花粉形成阶段逐渐消失。而在整个四分体时期一直表达的27.4 ku条带到了二核期花粉粒形成时期突然消失。此外，在二核期花粉粒形成时期（IX）出现了另外2个特异谱带，分别在64.2和37.6 ku。说明这些特异谱带可能对花粉形成的不同阶段有重要的作用。

3结论与讨论

植物的花发育是一个非常复杂的生理过程，与植物的繁殖和作物产量等直接相关，需要体内核酸、激素和蛋白等不同物质的参与[10]。通过可溶性蛋白含量和特异蛋白谱带检测，可以了解植物花发育的生理过程与内在因子间的相关性。已有研究表明植物体内可溶性蛋白含量的动态变化与植物成花间具有一定的相关性。如郭金丽等[11]对苹果梨花芽分化期蛋白质含量进行了观察研究，结果发现生理分化期花芽和成花短枝中蛋白质大量积累；形态分化期花芽各花器原基分化过程中富含蛋白质，成花短枝中蛋白质含量持续下降。陈清西等[12]研究发现，氯酸钾处理能明显促进龙眼开花，在成花诱导后，成花母枝叶片中蛋白质在诱导期迅速增加，之后逐渐下降，而对照植株蛋白质含量始终保持在较低水平。该研究发现，香榧花枝叶片可溶性蛋白含量随着雄球花发育进程有2个明显的表达高峰，而在雄球花花芽发育过程中，可溶性蛋白含量却呈现逐渐降低的趋势，说明叶片可能为雄球花发育提供了主要的蛋白。

除了可溶性蛋白含量与植物成花相关外，特异的蛋白组分可能对植物成花作用更为关键。肖华山等[6]对荔枝雌花发育过程的蛋白质研究发现，在荔枝雌花的4个不同发育期，都有一些新蛋白质合成，也有一些蛋白质分解消失，认为在雌花发育过程中，蛋白质的新陈代谢非常活跃，并且具有发育时期的特异性，可能与组织或细胞在该时期的特定生理功能有关。杨传平等[13]对白桦雄花序发育过程中的蛋白双向电泳后发现，有275个蛋白点在表达上有明显质和量的变化，某些蛋白点为特定发育时期的雄花序特有，这些表达差异的蛋白可能与花分生组织及花器官的形成有关。该研究对香榧雄球花不同发育时期的叶片和花芽可溶性蛋白进行SDSPAGE检测发现，在不同花芽发育时期，叶片、花芽中的大部分蛋白质基本保持不变，有部分蛋白质在不同时期出现、即将分解消失或已经分解消失，有的蛋白质只在某一个发育时期出现。这种现象说明在香榧雄株的成花阶段，蛋白质新陈代谢旺盛，一些与特定时期的花器官组织或细胞有关的蛋白质有明显的表达特异性。

参考文献

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