甘草黄酮对UVB损伤HDF细胞保护作用研究

付维维 刘娟 王业秋等

摘要[目的]研究甘草黄酮对UVB照射后产生光老化现象的HDF细胞保护作用。[方法]采用30 mJ/cm2的UVB照射HDF细胞建立损伤模型；加入不同浓度的甘草黄酮，24 h后MTT法检测细胞活性；用试剂盒法测定细胞上清液中谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活性、丙二醛（MDA）含量。[结果]甘草黄酮浓度为10-9、10-10、10-11 mol/L时，能使受UVB照射损伤的HDF细胞活性增强；甘草黄酮浓度为10-9、10-10 mol/L时，GSHPx、SOD活性升高，MDA含量降低；甘草黄酮浓度为10-11 mol/L時，SOD活性升高、MDA含量降低。[结论]甘草黄酮能减轻UVB对HDF细胞的损伤，其机制可能与抑制氧化损伤、提高SOD活性有关。

关键词甘草黄酮；光老化；UVB；HDF细胞；保护作用

中图分类号S567.7+1文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-170-02

Effects of Licoflavone on HDF Cytoprotection after UVB Injury

FU Weiwei1，2， LIU Juan1， WANG Yeqiu2， LI Jianmin2* et al （1. Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007； 2. College of Jiamusi， Heilongjiang University of Chinese Medicine， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] To research the effects of licoflavone on HDF cytoprotection after UVB injury. [Method] HDF was irradiated under 30 mJ/cm2 UVB to establish injury mode. After adding different concentrations of licoflavone， cell viability was detected by MTT method after 24 h. Contents of GSHPx， SOD and MDA in cell supernatant were detected by kit method. [Result] When licoflavone concentration was 10-9， 10-10 and 10-11 mol/L， HDF activities enhanced after UVB injury. When licoflavone content was 10-9 and 10-10 mol/L， contents of GSHPx， SOD and MDA reduced. When licoflavone content was 10-11 mol/L， SOD activity enhanced and MDA content reduced. [Conclusion] Licoflavone reduces the HDF injury induced by UVB. Its mechanism might be related to the restriction of oxidative damage and the enhancement of SOD.

Key wordsLicoflavone；Photoaging； UVB；HDF cell；Protection effects

皮肤是身体与外界环境直接接触的第一道防线，长期暴露于紫外线下会产生氧化应激效应[1]。因紫外线中UVB极大部分被皮肤表皮所吸收，很难渗入皮肤内部，所以多数研究者选择研究UVB对于皮肤表皮层中角质细胞的作用。但由于UVB阶能较高，可到达真皮层的成纤维细胞（HDF），导致被照射部位细胞发生代谢反应，伴随产生活性氧簇（ROS）[2]，抗氧化防御系统被破坏，产生机体氧化损伤，直接表现为皮肤松弛、干燥、纹理变粗、癌变等[3]。在抑制ROS诱导的损伤方面，人体内存在的多种抗氧化酶和非酶性抗氧化物发挥着巨大的作用，谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化酶可以清除机体内产生的ROS，维持机体平衡，但当机体内抗氧化物酶的活性降低或ROS产生过量时，机体细胞会受到损伤，引起氧化-抗氧化平衡系统破坏，产生DNA损伤、酶活性丧失及细胞凋亡等，发生皮肤发炎、皱纹，机体出现疾病（肿瘤）等[4]。

甘草黄酮对Fenton反应生成的羟自由基具有较强的直接清除作用[5]，并能与超氧阴离子结合，阻止自由基反应发生，降低脂质过氧化物丙二醛（MDA）的生成从而发挥其抗氧化功能及活性。叶怀义等[6]研究表明甘草黄酮能增强衰老小鼠SOD的活性，减少体内MDA的含量，延缓了小鼠衰老进程，提高了衰老小鼠抗应激能力。虽然关于甘草黄酮对皮肤光老化的研究较多，但仍处在起步阶段。因此，该试验通过研究甘草黄酮对UVB损伤的HDF细胞的保护作用，使用试剂盒检测法检测细胞上清液中GSHPx、SOD活性和MDA含量的变化，探讨甘草黄酮抗皮肤光老化作用，为进一步将其发展为安全有效的防紫外线制剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞。人皮肤成纤维细胞（HDF），来源于上海中乔新舟生物科技有限公司。

1.1.2试剂。FM培养液（上海中乔新舟生物科技有限公司）、胎牛血清（上海中乔新舟生物科技有限公司）、双抗（上海中乔新舟生物科技有限公司）、二甲基亚砜DMSO（Sigma公司）、MTT（Sigma公司）、胰蛋白酶（Billab公司）、PBS（北京中杉金桥有限公司）、细胞计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）、冰乙酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）、甘草黄酮对照品（质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司）。

1.1.3仪器。紫外照射仪（Sigma公司）、紫外线辐照计（北京师范大学光电仪器厂）、Research UV UF型超纯水制备系统（上海和泰仪器有限公司）、IX7121PH型Olympus倒置显微镜（日本Olympus株式会社）、HF90型二氧化碳培养箱（上海智城分析仪器有限公司）、ZHWY103B型小容量恒温培养振荡器（上海智城分析仪器有限公司）、BCM1000A型生物洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）、DK2000ⅢL型电热恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）、移液器（100～1 000 μl）、YB1201DW型電子天平（上海海康电子仪器厂）、85 K离心机（上海安亭科学仪器厂）、MS500A型半自动生化分析仪（四川美生科技有限公司）、MK3型酶标仪（上海热电仪器有限公司）、TGL16GC 型高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2方法

1.2.1药物与试剂配制。

1.2.1.1药物的配制。通过预试验发现甘草黄酮浓度>10-9mol/L 时对HDF细胞产生毒性，该试验将甘草黄酮加入FM培养液中，配制成高、中、低（10-9、10-10 、10-11mol/L）3个浓度，调pH为7.0，0.22 μm孔径滤膜滤过除菌，-20 ℃保存待用。

1.2.1.2 培养液的配制。培养液按照FM培养液∶胎牛血清∶双抗=89∶10∶1的比例配制，混匀后，4 ℃保存待用。

1.2.1.3MTT溶液的配制。称取250 mg MTT，放入小烧杯中，加45 mL PBS（无Ca2+、Mg2+离子，pH=7.2），在50 ℃水浴中搅拌溶解，50 mL容量瓶定容至50 mL，用0.22 μm孔径滤膜过滤除菌分装，-20 ℃保存待用。

1.2.2HDF细胞的复苏。从液氮灌中取出冻存管后，迅速投入37 ℃水浴的同时摇动冻存管，使其快速溶解，移入超净工作台中，将冻存的细胞悬液移入一无菌的离心管，同时向该离心管中加入3～4 mL新鲜FM培养液，混匀，1 500 r/min离心3 min，弃去上清，加入3～4 mL新鲜FM培养液吹悬细胞，转入新的培养瓶中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中进行培养，次日更换培养液，继续培养。

1.2.3HDF细胞的体外培养。HDF细胞在含有10%胎牛血清的FM培养液中，37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下进行培养，待细胞呈现80%～90%融合时进行处理。

1.2.4细胞分组及给药。接种于96孔板内的细胞分为空白对照组、模型组以及甘草黄酮高（10-9 mol/L）、中（10-10 mol/L）、低（10-11 mol/L）剂量组，每组设6个复孔。空白对照组：细胞加入FM培养液，培养48 h；模型组：培养24 h的细胞弃培养液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射细胞，弃PBS，加入不含药的FM培养液继续培养24 h；甘草黄酮组：细胞加入FM培养液，培养24 h后，弃培养液，每孔加入150 μL PBS，采用30 mJ/cm2 的UVB照射细胞，弃PBS，加入含不同浓度（10-9、10-10、10-11 mol/L）甘草黄酮的FM培养液继续培养24 h。

1.2.5指标检测。

1.2.5.1细胞中GSHPx、SOD活性和MDA含量。按照各试剂盒说明书，取细胞上清液进行测定。

1.2.5.2细胞活性。取5 mg/mL的MTT 20 μL加入至96孔板中，将其放入CO2 培养箱中孵育4 h后弃上清液加入150 μL的二甲基亚砜（DMSO），在恒温培养振荡器内振荡10 min，在492 nm处测定各孔吸光度值（OD值）。按公式计算细胞活性：细胞活性=OD试验组/OD对照组×100%。

1.3数据处理用SPSS17.0软件对数据进行统计分析，数据均以±s表示，多样本间的方差分析采用LSD法。

2结果与分析

2.1甘草黄酮对HDF细胞活性的影响由表1可知，与空白对照组比较，模型组细胞活性明显降低，两者具有统计学意义（P<0.01），表示细胞光老化模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，不同浓度的甘草黄酮组（10-9、10-10、10-11mol/L）分别不同程度地提高了细胞活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抑制UVB辐射引起HDF细胞的氧化损伤。

2.2甘草黄酮对HDF细胞中GSHPx、SOD活性的影响由表2可知，与空白对照组比较，模型组的GSHPx、SOD活性明显降低，两者具有统计学意义（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，不同浓度的甘草黄酮组（10-9、10-10、10-11mol/L）分别不同程度地提高了GSHPx、SOD活性（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抵抗UVB辐射引起HDF细胞的氧化损伤。

2.3甘草黄酮对HDF细胞中MDA含量的影响由表2可知，与空白对照组比较，模型组的MDA含量明显上升，两者具有统计学意义（P<0.01），表示模型建立成功；甘草黄酮组与模型组比较，10-9、10-10、10-11mol/L甘草黄酮作用于细胞时，明显降低了MDA的含量（P<0.01、P<0.05），表明甘草黄酮能抵抗UVB辐射引起的MDA外漏。

3讨论与结论

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）是一组具有未配对电子的原子或分子，包括超氧阴离子（superoxide anion，O2- ）、单线态氧（singlet oxygen，1O2）、过氧化氢（hydrogen peroxide，H2O2）、羟基自由基（hydroxyl free radical，·OH）等。正常情况下，人体内ROS的产生与消除处于平衡状态，当ROS增多时，细胞内的GSHPx、SOD、CAT等抗氧化酶可快速清除ROS，维持机体促氧化-抗氧化的平衡，但随着机体衰老或受某些外界因素（紫外线）影响时，会打破平衡状态，机体受到多余ROS的伤害。

GSHPx是一种含硒酶，由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸组成，可以调节硒消耗和形成，具有清除过氧化物和保护细胞免于氧化损伤的重要作用，能够解除过氧化氢的毒性，恢复氧化变性的大分子。SOD是最有效的超氧化自由基清除剂，可以有效预防或延缓皮肤老化。MDA是一种能够引起胶原蛋白长度缩短、性状发生变化的脂质过氧化产物，对细胞具有毒性。该试验以30 mJ/cm2的UVB照射HDF细胞，HDF细胞活性下降，细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）活性下降，丙二醛（MDA）含量上升。试验结果证明，甘草黄酮浓度为10-9 mol/L时，细胞活性显著升高；随着甘草黄酮浓度的增加（10-11、10-10 、10-9 mol/L），細胞GSHPx、SOD活性随之增加，MDA含量降低，中药甘草的主要活性成分甘草黄酮可能抑制氧化损伤、提高SOD活性，在防治皮肤光老化方面具有一定作用。

参考文献

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[2] EPE B.DNA damage spectra induced by photosensitization[J].Photochemical & photobiological sciences， 2012，11（1）： 98-106.

[3] 徐慧，刘健航，陈向东，等.非光暴露皮肤经窄谱中波紫外线照射前后MMP-1的表达[J].中国皮肤性病学杂志，2009，23（1）：11-12.

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[6] 叶怀义，龚赋岚，尚明，等.甘草黄酮抗衰老作用的研究[J].哈尔滨商业大学学报，2004，20（1）：93-97.