铺散亚菊超临界CO2 萃取挥发油成分及其抑菌活性研究

达洛嘉 马家麟 白雪等

摘要[目的]研究藏药铺散亚菊挥发油的主要成分及其抑菌活性。 [方法]采用超临界CO2法萃取铺散亚菊挥发油成分，采用气相色谱质谱联用（GC-MS）结合相对保留指数进行组分分析鉴定，并通过滤纸片扩散法筛选铺散亚菊挥发油对常见13种致病菌的抑菌活性。 [结果]从铺散亚菊超临界CO2萃取物中共分离出127个可识别峰，含量高于0.02%的化学成分为46种，占总萃取物的67.30%。铺散亚菊挥发油对乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌等11种供试菌表现出抑菌活性。 [结论] GC-MS结合保留指数对铺散亚菊超临界CO2萃取挥发油进行定性分析，使定性结果更为可靠。该研究结果可为铺散亚菊挥发油的抗菌活性研究提供试验依据。

关键词铺散亚菊；超临界CO2 萃取；GC-MS；抑菌活性

中图分类号R284.2文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-004-04

Study on the Chemical Constituents and Antibacterial Activity of the Volatile Oil from Ajania khartensis by Supercritical CO2 Fluid Extraction

DA Luojia，MA Jialin，BAI Xue，LIN Pengcheng* et al （Key Laboratory of Pharmaceutical Analysis in Qinghai Province，Key Laboratory of Plant Resources of QinghaiTibet Plateau in Chemical Research，College of Pharmacy，Qinghai University for Nationalities，Xining，Qinghai 810007）

Abstract[Objective] To research the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis，and to investigate their antimicrobial activities. [Method] The volatile oil from Ajania khartensis was obtained by supercritical CO2 fluid extraction，then combined GCMS analysis with retention index to appraise the chemical components，and screened antimicrobial activities of the volatile to thirteen common bacterial pathogens by filter paper diffusion method. [Result] 127 identifiable peaks were isolated from the volatile oil，among them，46 components′ relative content were higher than 0.02% which accounted for 67.30% of the total extract. The volatile oil from Ajania khartensis showed some antimicrobial activities against Salmonella paratyphy B and Enterobacter aerogenes. [Conclusion] It ensures the qualitative results by using GCMS and retention index to analyze the chemical components of volatile oil from Ajania khartensis.The filter paper diffusion method provides a reliable preparatory screening result for antimicrobial activities of volatile oil from Ajania khartensis.

Key wordsAjania khartensis； Supercritical CO2 fluid extraction； GCMS； Antibacterial activity

鋪散亚菊（Ajania khartensis），为菊科亚菊属多年生铺散草本，分布在印度、俄罗斯以及我国青海、云南、宁夏、西藏、四川、甘肃等地区，生长于海拔2 500～5 300 m的地区，一般生长于向阳山坡[1]，具有浓郁的特征气味。铺散亚菊在藏药典籍《晶珠本草》中记载为蒿阿仲，主要用于治疗肺热症[2]。张兴旺等[3]通过水蒸馏法提取铺散亚菊挥发油并使用GCMS进行分析鉴定，但使用超临界CO2 提取铺散亚菊挥发油及后续抑菌活性的研究则鲜见报道。笔者采用超临界CO2 通用条件对铺散亚菊挥发油进行萃取[4]，获得挥发油使用GCMS分离鉴定，结合相对保留指数进行更准确地定性[5]。致病微生物所引起的肺部感染属于中医肺热证范畴[6]。笔者用铺散亚菊治疗肺热，采用滤纸片扩散法[7-8]研究其挥发油对13种常见致病菌的抑菌效果，以佐证其在藏药中的功效。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌种。13株供试菌株购自中国药品生物制品检定所，具体见表1。

1.1.2药材。藏药铺散亚菊于2014年8月采自青海省互助北山林场，经青海民族大学药学院毛继祖教授鉴定为藏药铺散亚菊。

1.1.3试剂与耗材。CO2为医用级（北京市华元气体化工有限公司）；正构烷烃混合对照品（C7～C30），购自上海安谱科学仪器有限公司；营养琼脂，购自北京陆桥技术责任有限公司；蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；牛肉膏，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；氯化钠，购自天津市大茂化学试剂厂；丙酮，购自天津市富宇精细化工有限公司。所用试剂都为分析纯。耗材有滤纸片等（d=6 mm）。

1.1.4仪器。气相色谱/质谱联用仪，型号为7890A/5975C，为美国Agilent公司产品； G1888顶空进样器，为Agilent公司产品；四极杆质谱检测器；质谱检索数据库：NIST08 MS search 2.0；色谱数据处理系统（MSD Chemstation D.03.00.611），为美国Agilent公司产品；超临界CO2萃取仪，型号为7071（SFE-2），购自美国ASI公司；空压机；SDC6冷循环水系统；HZQX100A型恒温振荡培养箱，为上海一恒科学仪器有限公司产品；AS1060L型高压灭菌锅，为邝杏生物技术有限公司产品；SWCJ2FD型超洁净工作台，为苏州净化设备有限公司产品。

1.2方法

1.2.1超临界CO2萃取物的制备。将铺散亚菊全草粉碎后过60目筛，称取200 g投入1 L萃取釜中，加热萃取釜温度至50 ℃稳定，泵入CO2压力设定为25 MPa，静态萃取1.5 h，出样口温度100 ℃。

1.2.2铺散亚菊萃取物的GC-MS保留指数分析。

1.2.2.1样品制备。取0.01 g铺散亚菊萃取物，加到2 mL丙酮中充分溶解。

1.2.2.2色谱条件。色譜柱为HP5弹性石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；进样口温度250 ℃；载气为He 气，柱流量为0.8 mL/min。用于手动进样的程序升温条件为：初始温度60 ℃，保持1 min，再以3 ℃/min 升至150 ℃，保持5 min；以5 ℃/min升至260 ℃，保持10 min。进样量5 μL。

1.2.2.3质谱条件。标准质谱调谐；电离方式EI，电子能量70 eV；四级杆温度：150 ℃；离子源温度：230 ℃；辅助区温度：295 ℃；溶剂延迟时间：3 min；数据采集扫描模式：全扫描。质谱扫描质量范围（m/z）50～550。

1.2.2.4保留指数（KI）的测定。手动进样针精密移取正构烷烃混合对照品5 μL，按照“1.2.2.3”下的条件直接进样，经程序升温后得到条件分析的结果，用于组分KI 值的计算；记录该条件下C7～C30各正烷烃的保留时间，采用线性升温公式KI=100n +100（tx-tn）/（ tn+1- tn）计算各组分的KI 值，其中tx、tn和tn+1分别为被分析组分流出峰的保留时间和被分析组分保留时间相邻的碳原子数处于n 和n+1 之间的正烷烃（tn

1.2.3铺散亚菊挥发油的抑菌活性测定。

1.2.3.1菌种活化。①接种乙型溶血性链球菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌等11种细菌的新鲜培养物于营养肉汤培养基或营养琼脂培养基，30 ℃培养18～24 h。②接种白色念球菌和黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基上，25 ℃下培养3～5 d。

1.2.3.2菌悬液的制备。①将上述细菌培养物加入无菌0.9%氯化钠溶液配制成浓度为108 CFU/mL的菌悬液；②将上述真菌培养物加入3 mL无菌的0.9%氯化钠溶液（含0.05%（V/V）吐温80），混匀后将溶液表面的孢子缓慢吸出至无菌试管内，并配制成浓度为108 CFU/mL的孢子悬液。

1.2.3.3含菌平板的制备及最低抑菌浓度（MIC）的测定。采用滤纸片琼脂平板扩散法，对铺散亚菊挥发油的抑菌圈直径进行测定。用移液枪吸取已制备好的待试菌株菌悬液0.2 mL，加入200 mL的营养琼脂培养基或马丁氏培养基中，混合均匀。将带有菌悬液的培养基依次倒入培养皿中，待培养基凝固。配制不同浓度（2.00、1.00、0.50和0.25 mg/mL）的挥发油。用移液枪分别吸取4种不同浓度的挥发油溶液，加至滤纸片上，待滤纸片完全润透，用已灭菌的镊子将浸有挥发油溶液的滤纸片贴在待试菌培养基上，用丙酮或0.9%氯化钠溶液（含0.05%（V/V）吐温80）溶液作为空白对照。每个浓度进行3次平行试验。将含菌平板置于培养箱中，将细菌在30 ℃下培养18～24 h，真菌25 ℃条件下培养24～48 h后测量抑菌圈直径。置于培养箱培养10 h后，每1 h对平板进行观察，以抑菌圈最大直径为最终记录值。

2结果与分析

2.1超临界CO2萃取物所得萃取物为黄色固体，具有浓郁的香气。

2.2铺散亚菊萃取物的GC-MS保留指数分析以峰面积归一化法计算萃取物各组分相对含量，选择峰面积大于0.02%、NIST标准谱库匹配度高于90以上的组分共46个，并计算各峰与标准谱库匹配度前3位的组分保留指数，与NIST数据库中保留指数进行比较，以质谱和保留指数匹配度最接近的物质为最优结果。由表2可知，从铺散亚菊超临界CO2萃取物中共分离出127个可识别峰，按照以上条件鉴定出46种组分，占总萃取物的67.30%。

2.3最低抑菌浓度（MIC）平板产生抑菌效果时的挥发油最低浓度即为最低抑菌浓度。由表3可知，铺散亚菊挥发油对11种致病菌具有抑菌活性。其中，乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌的MIC值为0.50 mg/mL；金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌、乙型溶血性链球菌、白色念球菌的MIC值为1.00 mg/mL；蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌的MIC值为2.00 mg/mL。

3结论与讨论

笔者通过超临界CO2所萃取的铺散亚菊挥发油，外观上为黄色固体，具有浓烈的特异性气味，区别于常规水蒸汽蒸馏法提取的挥发油，这是由于超临界CO2 所萃取组分为小极性，含较多的脂肪族类化合物，此类物质常温下大多为固体，在挥发油中占据主要成分，因此通过超临界CO2 萃取的藏药铺散亚菊挥发油常温下为固态。在收集萃取物时应将出样口温度保持在100 ℃，以防止样品中所含水分在出样口结冰堵住管路，出样时气体流速不能过快，流速过快会使挥发油得率下降，尤其是低沸点组分容易流失。超临界CO2萃取法具有提取得率高、没有有机溶剂残留、操作温度低、萃取物纯度高等优点，非常适合于高效率制备植物挥发油成分[9]。

GC-MS结合相对保留指数对铺散亚菊挥发油进行分析鉴定，能够使鉴定结果更为准确。从铺散亚菊超临界CO2萃取物中共分离出127个可识别峰，其中峰面积大于0.02%，NIST标准谱库匹配度高于90以上的组分46个，占总萃取物的67.30%，其中以脂肪酸类、烃类、醇类、酯类为主要成分。脂肪酸中亚麻油酸含量高达20.15%，具有調节血脂作用、预防心肌梗塞和脑梗塞、抗炎等作用[10-11]。

笔者通过滤纸片琼脂平板扩散法对铺散亚菊挥发油进行抑菌试验，发现对乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希氏杆菌、乙型溶血性链球菌、白色念球菌、蜡样芽胞杆菌、铜绿假单胞菌11种供试菌具有抑菌作用，且对其中的乙型副伤寒沙门菌、产气肠杆菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯菌4种菌具有较好的抑菌作用。铺散亚菊挥发油浓度与抑菌效果成正比，铺散亚菊挥发油浓度越高，抑菌效果越好，而且无论是革兰氏阴性菌还是革兰氏阳性菌，均有着明显的抑菌活性，说明铺散亚菊挥发油有广谱、高效的抗菌活性。该试验结果可为今后对铺散亚菊挥发油在抑菌方面的开发提供有效的试验依据。

参考文献

[1] 中国科学院植物志编辑委员会.中国植物志：第76（1）[M].北京：科学出版社，1999：46.

[2] 帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].上海：上海科学技术出版社，2012： 193.

[3] 张兴旺，朱鹏程，梅丽娟，等.铺散亚菊挥发油化学成分研究[J].天然产物研究与开发，2010（B08）：36-38.

[4] 杨必成，杨义芳.超临界流体萃取中药及天然产物的样品制备和预处理方法研究进展[J].中草药，2010，41（8）：391-394.

[5] 梁晟，李雅文，赵晨曦，等.GCMS结合保留指数对中药挥发油的定性[J].分析测试学报，2008，27（1）：84-87.

[6] 卢红蓉.清燥救肺汤治疗肺热证（肺部感染）的文献和实验研究[D].北京：北京中医药大学，2006.

[7] 罗建军，曾涌，陈卫琼，等.亚菊属植物化学成分和药理活性研究进展[J].中药材，2014，37（12）：2304-2311.

[8] 黄赛金，尹爱武，罗紫英，等.高良姜挥发油抑菌及抗氧化作用研究[J].食品工业科技，2015（19）：112-115.

[9] 高艳霞，苏延友，贾凤娟，等.超临CO2流体萃取及GCMS联用技术优化提取和分析四叶参挥发油成分[J].中国新药杂志，2015（14）：1665-1669.

[10] 张春娥，张惠，刘楚怡，等.亚油酸的研究进展[J].粮油加工，2010（5）：18-21.

[11] 赵敏.亚油酸及亚油酸甲酯的抗炎作用研究[D].成都：西南交通大学，2012.