腺病毒与慢病毒感染牛肌肉原代细胞的研究

赵璐 付长振 赵志东等

摘要[目的]比较腺病毒和慢病毒侵染牛肌肉卫星细胞MOI值的差异，选择较优的侵染方式。[方法]从新生牛犊背最长肌中分离并纯化出牛肌肉卫星细胞，通过病毒侵染靶细胞的方法比较腺病毒和慢病毒对牛肌肉卫星细胞的侵染能力，确定最佳感染复数（Multiplicity of infection，MOI）。[结果]成功分离出牛肌肉卫星细胞，经过体外培养，可以用于细胞侵染研究；随着MOI值的增大，腺病毒和慢病毒侵染的细胞荧光强度均逐渐增强；当腺病毒侵染牛肌肉卫星细胞的MOI值为3 000，慢病毒侵染靶细胞的MOI值为300时，荧光强度均较强，细胞形态即将发生变化。相对而言，慢病毒较腺病毒更易侵染原代肌肉细胞，并且荧光强度较强，但侵染效率比较低。[结论]对于原代细胞，选择慢病毒侵染更为合适。该试验结果为应用腺病毒或慢病毒介导的功能基因在牛肌肉卫星细胞中的过表达或干扰沉默研究提供了参考资料。

关键词牛肌肉卫星细胞；腺病毒；慢病毒；MOI

中图分类号S858.23文献标识码A文章编号0517-6611（2016）04-147-04

Study on Adenovirus and Lentivirus Infection of Bovine Muscle Primary Cells

ZHAO Lu1， FU Changzhen2， ZHAO Zhidong2， LIU Yongfeng1* et al（1.College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062； 2. College of Animal Science and Technology， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract[Objective] The aim was to compare the difference of MOI values between the adenovirus and the lentivirus infected bovine muscle satellite cells， and to select the best method of infection.[Method] Bovine muscle satellite cells were isolated and purified from newborn calf of longissimus muscle， infection ability of adenovirus and lentivirus to bovine muscle satellite cells were compared to determine the optimal MOI.[Result] Bovine muscle satellite cells were successfully isolated， which can be used for the study of cell infection by cultured in vitro. It was found that， with the increase of MOI values fluorescence intensity gradually increased for infected cells， the MOI infection of bovine muscle satellite cells was 3 000 for adenovirus with strong fluorescence. While， lentivirus infection of target cells MOI increased to 300 having strong fluorescence， and morphology will be changed. In comparison， lentivirus more easily than adenovirus infected primary cells， and the fluorescence intensity was stronger， but the infection efficiency was relatively low.[Conclusion] It is appropriate to select lentivirus infection of primary cells. The result provides reference for research of cattle genes function via using denovirus or lentivirus genes mediated bovine muscle satellite cells express or disturbanced in silence.

Key wordsBovine muscle satellite cells； Adenovirus； Lentivirus； MOI

骨骼肌衛星细胞是附着在骨骼肌肌纤维上对出生后骨骼肌生长和肌肉再生修复具有重要作用的一类干细胞[1]。激活后的肌卫星细胞即为肌肉前体细胞，经过多个回合的分裂，最后形成肌纤维[2]。肉牛不论是产肉量还是肉品质都与骨骼肌卫星细胞的数量、性质有密不可分的关系。出生以后的骨骼肌的生长主要依靠肌肉卫星细胞的补充，这些具有干细胞特性的细胞经过增殖和分化以后最终融合到已存在的肌纤维中[3]。肌肉卫星细胞的增殖和分化能力还影响着肌纤维的组织学特性，因此其对肉品质也有重要影响[4]。

腺病毒最早发现于1953年，由于它们倾向于感染上皮细胞而被命名为腺病毒（Adenovirus）。腺病毒是直径为70～90 nm的无囊膜病毒，呈二十面体对称结构[5]。根据宿主范围的不同，将腺病毒分为哺乳动物腺病毒属（Mastadenovirus）和禽类腺病毒属（Aviadenovirus）2个属。根据免疫学、生物学、生物化学特性的不同，将其分为A～G 7个亚种，共有52个血清型[6]。慢病毒属（Lentivirus）在分类上属于逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。原发感染的细胞以淋巴细胞和巨噬细胞为主，导致感染个体发病。由于慢病毒感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前经历较长的潜伏期，之后缓慢发病，因此被称为慢病毒。例如，人类免疫缺陷病毒（HIV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、马传染性贫血（EIA）、猫免疫缺陷病毒（FIV）均隶属慢病毒属[7]。随着科学技术的不断发展，腺病毒和慢病毒载体已经广泛用于基因功能以及基因治疗的研究。

目前，对牛肌肉卫星细胞的研究相对较少，也没有成熟的细胞系，需要原代培养，并且这种原代培养的细胞在传代培养几代后细胞状态就会发生变化，不能继续使用。另外，试验也表明很难实现应用脂质体介导外源基因高效导入牛肌肉卫星细胞。考虑到病毒载体具有能够侵染各种难侵染的细胞以及高侵染效率等优点，目前最广泛应用的病毒载体有腺病毒载体和慢病毒载体，由于这2种病毒在使用上各有特点，并且暂没有发现应用这2种病毒载体介导的外源基因导入牛肌肉卫星细胞来研究基因功能。笔者分离培养原代牛肌肉卫星细胞，获得高纯度与高滴度的慢病毒与腺病毒，然后应用这2种病毒分别侵染牛肌肉卫星原代细胞，通过绿色荧光蛋白表达情况在显微镜下观察不同病毒的侵染效果，确定不同病毒侵染牛肌肉卫星细胞的最佳感染复数（MOI），旨在为在牛肌肉卫星细胞中应用病毒载体介导的基因功能的研究提供参考资料。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料。牛背最长肌，取自西北农林科技大学国家肉牛改良中心良种繁育场的1头新生秦川牛公牛。

1.1.2试剂。慢病毒Lenti6.3RNAi和腺病毒AdeGFP，均购自Invitrogen公司；DMEM、FBS和polybrene，均购自Life公司；胎牛血清和马血清，均购自Gibco公司；Ⅰ 型胶原酶和牛血清蛋白（BSA），购自Sigma公司。

1.1.3耗材与仪器。细胞培养瓶，购自Corning公司；96孔板，購自Thermo Fisher公司；CO2培养箱，为Thermo公司产品；荧光显微镜，为Olympus公司产品；离心机，为Sigma公司产品。

1.2牛肌肉卫星细胞的分离培养参照刘扬[4]的方法对牛肌肉卫星细胞进行分离与培养。取新鲜的牛背最长肌，使用无菌的器械将肌肉块从胴体上分离后，置于75%的乙醇中浸泡并轻轻振荡，并在30 s内将肌肉块迅速转移到无菌的PBS中。在超净台中用无菌的PBS将肌肉块清洗3遍以后，用剪刀和镊子将肌肉块上的肌膜等结缔组织剔除干净，然后将肌肉剪碎成1 mm×1 mm×1 mm左右的小块。将剪碎的肌肉团转移至0.2%的 Ⅰ 型胶原酶中，在37 ℃条件下消化2～3 h。消化到可以将肌肉块吹散，加入等体积的细胞培养液（DMEM+10%FBS）终止消化。将终止消化后的悬液以1 500 r/min的转速离心5 min。离心结束后弃去上清液，将下层的细胞团用含10% FBS的DMEM清洗2遍，然后用400目细胞筛进行过滤。

采用QuPetersen等[8]的方法对肌肉组织中不同的细胞类群进行分离。首先将过滤到的细胞悬液以1 500 r/min的转速离心5 min，弃去上清，将细胞团块用牛肌肉卫星细胞增殖培养液PM（DMEM+20%FBS+10%HS）重悬，加入到培养瓶1中，在37 ℃、含0.5% CO2的饱和湿度环境下培养。培养2 h后，将悬浮液转移到另一个培养瓶2中，培养瓶1中贴壁的细胞在加入PM后继续进行培养，并将此细胞类群记为pp1。培养瓶2中的细胞培养24 h后，又将悬浮液转移到培养瓶3中，贴壁的细胞继续培养并记为pp2。培养瓶3中的细胞培养24 h后，将悬浮液转移至培养瓶4中，并将贴壁细胞记为pp3。用相同的方法得到pp4、pp5和pp6细胞类群。在此过程中，每2 d更换1次新鲜的PM。最后，分离得到牛肌肉卫星细胞。

1.3腺病毒侵染牛肌肉卫星细胞测定MOI值牛肌肉卫星细胞用胰蛋白酶消化计数后，按照1×104 cell/孔接种至96孔板中，于37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养。更换DMEM+2%FBS培养基培养，然后根据细胞数量以MOI值分别为0、5、10、20、50、100、500、1 000、2 000和3 000，滴加不同量的重组腺病毒AdeGFP悬液，每组设3个重复。6 h后更换PM后继续培养，72 h后置于显微镜下观察GFP的表达情况。根据细胞感染百分率和细胞形态，确定细胞适合的最佳MOI值。

1.4慢病毒侵染牛肌肉卫星细胞测定MOI值牛肌肉卫星细胞用胰蛋白酶消化计数后，按照1×104cell/孔接种至96孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中过夜培养。更换DMEM+2%FBS+8 μg/mL polybrene培养基培养，然后根据细胞数量，以MOI值分别为2、5、10、20、50、100、200和300，滴加Lenti6.3RNAi病毒悬液，每组设置3个重复。侵染6 h后更换PM培养基继续培养，72 h后显微镜下观察GFP的表达情况。根据细胞侵染百分率和细胞形态，确定细胞适合的最佳MOI值。

2结果与分析

2.1牛肌肉卫星细胞分离与培养根据细胞贴壁能力的不同，分别将接种后2、24、48、72、96和120 h贴壁的细胞，在PM中培养至70%汇合度时，细胞均呈梭形。从pp1细胞到pp6细胞，细胞的长轴呈变短的趋势，转瓶次数越多的细胞类群，贴壁的细胞需要时间越长，其形态更接近于干细胞，而转瓶次数越少的细胞，能够很快贴壁的细胞更接近于成纤维细胞的形态。解冻鉴定后的牛肌肉卫星细胞于PM培养基中，在37 ℃、饱和湿度5%CO2 培养箱中培养。从图1可以看出，牛肌肉卫星细胞呈梭状贴壁生长，状态良好。

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