体外操作对人精子运动参数及细胞内活性氧簇的影响

史潇，王婷，周瑶，刘厉，詹晓敏，陈思梅，全松

体外操作对人精子运动参数及细胞内活性氧簇的影响

史潇，王婷，周瑶，刘厉，詹晓敏，陈思梅，全松

目的：研究体外物理操作（离心以及微量加样器抽吸）对人精子运动参数以及细胞内活性氧簇（ROS）的影响，旨在优化人精子体外处理方法。方法：7例精液常规参数正常的标本，采用不同离心力（200 g，600 g）及离心时间（5min，15min）以及不同微量加样器抽吸次数（2，6，10次）进行处理，测试精子运动参数和细胞内ROS的变化。结果：①活动精子百分比以及活精子细胞内ROS水平主要受到离心时间的影响（P＜0.05）；前向运动精子百分比（PR）以及平均运动速率（VAP）均不受离心力及离心时间的影响（P＞0.05）。单因素方差分析多重比较结果提示，当离心时间为5min以上时精子活动力显著下降，而ROS水平显著增加（P＜0.05）。②加样器抽吸2次以上可致人精子活动力显著下降（P＜0.05），抽吸6次以上可导致人精子PR及VAP显著降低（P＜0.05）；但抽吸操作并未显著影响精子细胞内ROS的水平。结论：在人精子体外操作时应尽量缩短离心时间并控制加样器抽吸次数从而保证正常的精子运动参数，也应尽量缩短离心时间从而减少体外操作所致的细胞内ROS升高。

精子；精子能动性；离心法，梯密度；抽吸；氧化性应激；受精，体外

【Abstract】Objective:To study the effects of centrifugation and pipette on humanmotility and intracellular ROS，so as to optimize the sperm handling procedure.Methods:Seven sperm samples with normal seminal parameters were treated with various centrifugation force（200 g，600 g）and centrifugation duration（5 min，15 min）and different pipetting times（2，6，10 times）.Motility parameter and intracellular ROS were measured. Results:For the centrifuge procedure，the centrifugation duration could significantly influence the sperm motility and intercellular ROS level（P＜0.05），while centrifugation did not significantly influence the percentage of progressivemotile sperm（PR）and the velocity of average path（VAP）（P＞0.05）.The centrifugation durationmore than 5 minutes could significantly decrease the sperm motility and intracellular ROS level（P＜0.05）.For the pipetting procedure，the pipetting more than 2 times would significantly decrease the sperm motility（P＜0.05），while the pipetting over 6 times would significantly decrease the PR and VAP（P＜0.05）.However，the intracellular ROS levelwas not significantly changed by the repeated pipetting.Conclusions:The special causion is that the centrifuge over 5 m inutes and pipetting over 2 times should be avoided during in vitro hand ling human sperm sample.

【Keywords】Spermatozoa；Sperm motility；Centrifugation，density gradient；Suction；Oxidative stress；Fertilization in vitro

（JIntReprod Health/Fam Plan，2016，35：369-371）

精液体外处理是辅助生殖技术（assisted reproductive techniques，ART）的常规步骤，离心、加样器抽吸等体外操作是精液分析、冷冻以及优选等过程中必不可少的操作。根据以往对小鼠、大鼠等动物精子体外操作的经验，离心、加样抽吸等物理操作均可能造成精子损伤，并且不同动物精子对于离心、抽吸等体外操作的敏感性不同，因而精子所受损伤的程度也不同［1-4］。在ART临床应用及科学研究中如何优化精子体外处理的条件是学者们共同关注的问题，然而目前仍缺乏人精子体外处理的相关实验证据。本研究采用析因分析的方法，探讨离心力、离心时间以及加样器抽吸次数等操作对人精子运动参数以及细胞内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的影响，旨在为优化ART过程中精子体外处理条件提供参考。

1　资料与方法

1.1标本收集根据世界卫生组织（WHO）第5版精液参数参考值，收集南方医科大学南方医院妇产科生殖中心有生育史且精液常规分析参数正常的30～40岁男性精液标本7例（禁欲3～5 d，手淫法取精）。本研究经南方医科大学南方医院伦理委员会批准同意采用精液常规分析后剩余标本进行研究。

1.2主要仪器与试剂①CASA精液分析仪（SCA全自动精液分析系统，西班牙Microptic S.L.公司）；②离心机（Sorvall Legend Mach 1.6/R，美国Thermo公司）；③正置显微镜（BX51，日本Olympus公司）；④流式细胞仪（美国BectonDickinson公司）；⑤ROS分析试剂盒（H2DCFDA，KGAF018，南京凯基生物公司）；⑥碘化丙啶（PI）染色试剂盒（KGA214，南京凯基生物公司）；⑦人输卵管液（Human Tubal Fluid，HTF）按照文献［5］配制。

1.3研究方法

1.3.1实验分组本研究共分为3个大组，分别为对照组、离心处理组以及抽吸处理组。其中离心处理组分为4个亚组（200 g，600 g；5min，15m in；两个因素各水平组合）；抽吸处理组分为3个亚组（2，6，10次抽吸）；对照组不做任何处理。每份标本同时完成上述3个大组的实验。

1.3.2精子体外操作的处理实验Ⅰ为离心力及时间对精子的作用，实验Ⅱ为抽吸对精子的作用。实验Ⅰ的具体方案为：离心处理组的每个亚组取1×106个精子置于1.5mLEP管中加入200μLHTF。分别采用200 g，600 g的离心力及5m in，15min的离心时间进行离心。共有4个亚组。对照组精子于37℃静置，不进行离心处理。实验Ⅱ的具体方案为：抽吸处理组的每个亚组取10×106个精子加入1mLHTF。置于1.5mLEP管中，采用1 000μL微量加样器分别抽吸2，6，10次。共有3个亚组。对照组不进行抽吸处理。

1.3.3精液参数分析将射精后的精液置于干净的一次性取精杯内，观察精液一般性状，然后置入37℃恒温金属浴保温槽内孵育，待其液化进行检测。离心和抽吸处理组在完成相应体外处理后，再次进行精液参数检测。检测时取7μL液化的精子悬液于一次性精子计数板（荷兰Leja公司）上，置于显微镜载物台上静置1min后开始采用CASA精液分析系统分析精子活动率、前向运动精子百分比（PR）以及精子平均运动速率（VAP）。每份样本分析4个视野。

1.3.4精子细胞内ROS检测每份样本均按照ROS检测试剂盒（H2DCFDA）的操作步骤进行检测。将200μL浓度为106/mL的精子悬液与200μL的H 2DCFDA工作液及1μL PI工作液于37℃共同孵育30min。将孵育后的精子悬液标本进行物理应激处理，随后采用流式细胞分析仪分析2’，7’-二氯荧光素（DCF）荧光强度，从而检测细胞内ROS的产生情况。流式细胞仪激发波长488 nm，采用前向散射光（FSC）和侧向散射光（SSC）设门后，通过FL1（绿）检测DCF荧光强度，FL2（红）检测PI荧光强度。每份样本收集10 000个细胞。并采用Flow J软件分析数据，计算存活精子DCF平均荧光强度（DCFMFI，即PI阴性群中DCF平均荧光强度）。

1.4统计学方法采用SPSS16.0进行统计学分析，定量资料正态分布的数据用均数±标准差（x±s）表示，实验Ⅰ为2×2析因设计资料，实验Ⅱ为单因素3水平设计资料，分别采用析因方差分析和单因素方差分析进行数据分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1存活精子细胞内ROS的检测本研究采用PI和H2DCFDA联合染色检测存活精子细胞内的ROS水平，避免了混杂的死精子影响ROS检测的结果。通过PI染色区分存活与凋亡细胞群，H2DCFDA染色计算得出DCFMFI评估细胞内ROS的含量。流式细胞仪分析结果见图1。

图1　H2DCFDA/PI双染精子细胞结果图

2.2离心力及离心时间对人精子的影响析因分析结果提示，活动精子百分比以及活精子细胞内ROS（即DCFMFI）主要受离心时间的影响；PR以及VAP均不受离心力或离心时间的影响。进一步进行单因素方差分析多重比较发现，当离心时间为5min和15min时精子活力显著下降（P=0.01），同时活精子细胞内ROS水平也显著增加（P=0.00）。见表1。

2.3加样器抽吸次数对人精子的影响加样抽吸次数的增加可致活动精子百分比、PR以及VAP显著下降（P＜0.05），但并不引起存活精子细胞内ROS水平产生变化。进一步进行多重比较提示，当1mL的微量加样器抽吸精子2次及以上即可造成活动精子百分比的下降（P＜0.05），在抽吸达到6次及以上可造成PR以及VAP的显著下降（P＜0.05）。多重比较也提示细胞内ROS水平并无显著改变（P＞0.05）。见表2。

表1　离心力及离心时间对人精子的影响（x±s，n=7）

表2　微量加样器抽吸次数对人精子的影响（x±s，n=7）

3　讨论

在ART中如何优化精子处理条件以减少对精子损伤是辅助生殖领域长期探讨的热点问题。一些研究报道了经过体外操作后动物精子活动力、膜完整性改变的现象［1-4］，然而人精子的相关研究资料较为缺乏。本研究根据实际操作中ART实验室常用的人精子离心处理参数进行析因设计，设定离心力参数为200 g、600 g同时离心时间参数为5min、15min进行研究。发现当离心时间增加至5min时，人精子活力显著下降，而ROS水平显著增加。而与对照组比较的结果也提示，离心时间增加可导致精子活动率的进一步下降。这一研究结果与本研究团队的动物精子研究结果相似［4］。Kim等［2］以及Katkov等［5］的动物实验研究结果也证实了这一点。离心导致精子活动率以及PR的原因可能是由于离心过程中小鼠精子成团，尾部折叠而致的运动能力损伤［2］。本研究还发现，离心操作显著增加人精子内的ROS水平。过高水平的ROS可能会影响精子的功能和受精能力，并导致精子DNA损伤［6］。因此，在精子体外操作的过程中必须尽量减少人为操作带来的细胞内ROS水平升高。本文研究结果提示，人精子体外处理操作中，离心时间应控制在5min以内，以减少对精子活动力的损伤。

本研究还发现，对人精子实施抽吸操作不宜超过2次，否则人精子活动率下降，而加样器抽吸超过6次时PR以及VAP均会显著降低。这一结果与本研究团队对小鼠精子的研究结果相似［4］，同时也与Varisli等［1］以及Kim等［2］的动物实验研究结果相似。Varisli等［1］认为造成这一现象的原因与抽吸过程的机械剪切力有关，抽吸并未导致精子细胞内ROS水平的改变，这可能是因为抽吸操作所致的氧化应激强度不高，小鼠精子内的抗氧化系统（anti-oxidative system）足以将ROS还原，因此不至于使ROS水平升高。

本研究针对离心、抽吸操作对有生育史、精液参数正常人精子的影响进行研究，试图优化人精子体外操作的条件，为ART的操作过程提供参考。本研究发现加大离心力、延长离心时间以及加样抽吸均会影响精子的活动力，同时可能增加精子内源性ROS的产生。根据本研究的结果，建议在ART中体外离心人精子时应控制离心时间不超过5min，抽吸次数少于2次。然而，在ART的操作过程中更多涉及到的是精液参数异常患者精子的处理。精液参数异常的精子标本比正常精子标本更易产生内源性ROS，从而影响体外处理后的精子质量［7］。本研究的局限性在于未能够探讨经过离心、抽吸等操作后精子功能的变化以及对妊娠结局的影响，同时未能够对处理后的精子功能和DNA完整性进行评估。今后的研究可对精液参数正常和异常的精液标本处理前后，精子结构、DNA完整性等指标进行更完善的评估，进而对临床ART操作有更为全面的指导意义。

［1］VarisliO，Uguz C，Agca C，et al.Various physical stress factors on rat sperm motility，integrity of acrosome，and plasmamembrane［J］. JAndrol，2009，30（1）：75-86.

［2］Kim S，AgcaC，Agca Y.Effectsofvariousphysicalstress factorson mitochondrial function and reactive oxygen species in rat spermatozoa［J］.Reprod FertilDev，2013，25（7）：1051-1064.

［3］Agarwal A，Makker K，Sharma R.Clinical relevance of oxidative stress in male factor infertility：an update［J］.Am J Reprod Immunol，2008，59（1）：2-11.

［4］史潇，王婷，刘厉，等.体外操作对小鼠精子参数及内源性ROS的影响［J］.国际生殖健康/计划生育杂志，2015，34（6）：503-506.

［5］Katkov II，Mazur P.Influence of centrifugation regimes onmotility，yield，and cell associations ofmouse spermatozoa［J］.JAndrol，1998，19（2）：232-241.

［6］Aitken RJ，Smith TB，Jobling MS，et al.Oxidative stress and male reproductive health［J］.Asian JAndrol，2014，16（1）：31-38.

［7］Guz J，Gackowski D，Foksinski M，et al.Comparison of oxidative stress/DNA damage in semen and blood of fertile and infertilemen［J］.PLoSOne，2013，8（7）：e68490.

The E ffect of Physical Stress on Hum an Sperm M otility and Intracellular ROS Generation

SHI Xiao，WANG Ting，ZHOU Yao，LIU Li，ZHAN Xiao-min，CHEN Si-mei，QUAN Song.
Center for Reproductive Medicine，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 501515，China
Corresponding author:QUAN Song，E-mail:quansong@smu.edu.cn

2015-12-17）

［本文编辑王昕］

广东省科技计划项目（311220700174）；南方医科大学南方医院院长基金项目（2013C026）

510515广州，南方医科大学南方医院生殖中心

全松，E-mail：quansong@smu.edu.cn