酸酶复合法优化鱼鳞胶原蛋白的提取工艺

冯文婕 赵粼 阙斐

摘要：以鱼鳞为原料，经过粉碎、脱杂蛋白、脱矿物质等预处理，采用酸酶合解法提取胶原蛋白。结果表明，以0.1 mol/L NaCl脱杂蛋白，0.3 mol/L EDTA脱矿物质，柠檬酸和胃蛋白酶为提取介质有利于胶原蛋白的提取；影响鱼鳞胶原蛋白提取效率的主要因素分别为柠檬酸浓度、酶用量、提取时间，为保证蛋白质不变性，最佳的提取工艺，柠檬酸浓度为3%、酶用量为鱼鳞质量的7%、提取时间6 h、提取温度25 ℃（室温），此时羟脯氨酸的提取量为2.395 μg/g。表明采用酸酶复合法进行胶原蛋白的制备，不仅可以保证胶原蛋白的完整性，还有助于提高其产率。

关键词：鱼鳞；胶原蛋白；提取；酸酶复合法

中图分类号：S986.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）05-1242-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.039

Optimization of Extraction Collagen from Scales Using Acid

and Enzymatic Composite Process

FENG Wen-jie，ZHAO Lin，QUE Fei

（Zhejiang Economic & Trade Polytechnic， Hangzhou 310018， China）

Abstract：Fish scales were used as raw material to extract collagen with acid and enzymatic composite process after pretreatment. The optimal solvent for removing impurity proteins and mineral impurities from fish scales respectively with 0.1 mol/L NaCl and 0.3 mol/L EDTA. The main factors affecting the efficiency of the extraction of collagen were respectively： citric acid concentration， enzyme dosage and Time. To ensure the invariance of protein， the optimal parameters for extraction were 3% citrate acid，amount of enzyme on the basis of 7% the weight of fish scales for 6 h at 25 ℃（room temperature）. Under these conditions，the extraction amount of hydroxyproline was up to 2.395 μg/g. Extraction collagen from scales using acid and enzymatic composite process，which not only ensure the integrity of collagen， but also helps to improve the yield.

Key words： scale； collagen； extraction； acid and enzymatic composite process

中國淡水鱼产量约占全国水产总量的60%左右，近年来，中国淡水鱼养殖业迅猛发展的同时也带动了水产加工业规模的不断提高，这也就意味着养殖产量较高的低值淡水鱼加工品的比例将越来越大，其加工下脚料如鱼鳞、鱼皮等也将逐年增长[1]。研究表明，淡水鱼鱼鳞、鱼皮中含有丰富的胶原蛋白，在化妆品、生物医学材料以及食品添加剂等领域均具有潜在的开发和应用价值[2-4]。

胶原蛋白是结缔组织中极其重要的一种结构蛋白，广泛存在于动物的骨、腱、肌鞘、韧带、肌膜、软骨和皮肤中。胶原蛋白的提取方法对如何获取高活性、高产率的胶原产品具有至关重要的影响。目前，国外从海洋鱼类鱼鳞中提取胶原蛋白的工艺已较成熟，其胶原蛋白的提取率达到了25%～55%，并已运用于工业化生产[5]。而国内有关鱼鳞中提取胶原蛋白的研究还处于起始阶段。目前，国内针对淡水鱼中胶原蛋白的提取工艺和提取方法主要有酸提法、酶解法等[6-8]。酸提法与酶解法相比，成本低，但周期长，胶原蛋白得率也低；用酶解法虽可以提高胶原蛋白的得率，但一般用酶量大、条件剧烈。采用酸酶复合法进行胶原蛋白的制备，可保证较高产率的同时，缩短周期，减少酶的用量，更好地保证鱼鳞胶原蛋白中多肽的功能性[9，10]。本试验以鱼鳞为原料，经过粉碎、脱杂蛋白、脱钙矿物质等预处理，采用酸酶合解法优化鱼鳞胶原蛋白提取工艺，为中国淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的开发和应用提供可以借鉴的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜鱼鳞（市售鲫鱼的新鲜鱼鳞）；羟脯氨酸标准品（上海时代生物科技有限公司）；氯胺T（上海谱振生物科技有限公司）；二甲氨基苯甲醛（上海紫一试剂厂）；动物胃蛋白酶（南宁庞博生物工程有限公司）；EDTA（上海德颖生物科技有限公司，分析纯）；柠檬酸（上海瑞特良化工有限公司，分析纯）。

高速万能粉碎机（FW-80型，北京紫光仪器仪表销售有限公司），高速离心机（LG10-24A型，北京京立离心机有限公司），电子天平（SPS202F型，梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 胶原蛋白制备工艺的流程 鱼鳞洗净→烘干、粉碎→氯化钠脱杂蛋白→去离子水洗净、过滤→EDTA脱钙→去离子水洗净、过滤→恒温水浴锅中酸酶复合法提取胶原蛋白。

1.2.2 羟脯氨酸标准曲线的绘制 通过测定胶原蛋白特征氨基酸——羟脯氨酸（Hyp）的含量，间接评价胶原蛋白的提取效果。将Hyp标准液经氯胺T氧化后，与显色剂二甲氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在560 nm处测定其吸光度。

标准储备液：称取50 mg羟脯氨酸标准品于100 mL容量瓶中，用去离子水溶解，加一滴3 mol/L硫酸溶液，用去离子水定容。

移取5.00 mL上述标准储备液至500 mL容量瓶中，用去离子水定容。分别移取该溶液0、10.00、20.00、30.00、40.00 mL于100 mL的容量瓶中，用去离子水定容，所得标准工作液浓度依次为0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL，空白用去离子水作对照，分别吸取上述标准液1 mL 加入1 mL 柠檬酸缓冲液和1 mL 0.05 mol/L 氯胺T溶液，室温（25 ℃）氧化10 min 后，加入高氯酸1 mL（3.5 mol/L），放置10 min，加入对二甲基氨基苯甲醛试剂1 mL，在65 ℃水浴显色10 min，冷却后在560 nm处测定其吸光度，以羟脯氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出回归方程。

1.2.3 羟脯氨酸含量的测定 吸取10 mL提取液，按照“1.2.2”的方法测定提取液中羟脯氨酸的含量，以此表征胶原蛋白的提取效果。

1.2.4 杂蛋白脱除工艺的优化 采用NaCl溶液作为脱杂剂，进行脱杂蛋白处理。精确称取1 g鱼鳞，加入NaCl溶液，浸泡一定時间后，吸取脱杂上清液，分别测定其在280 nm 和560 nm处的吸光度[1]，比较在不同浓度NaCl、脱杂温度、脱杂时间、料液比（鱼鳞∶NaCl溶液，m∶m，下同）等条件下，NaCl脱除杂蛋白的效果和胶原蛋白的流失情况。

1.2.5 矿物质脱除工艺的优化 采用EDTA溶液作为脱杂剂，进行脱除矿物质处理。精确称取1 g鱼鳞，加入EDTA溶液，浸泡一定时间后，吸取脱杂上清液，测定脱杂液中钙的含量和羟脯氨酸的溶出量。比较在不同浓度EDTA、脱杂温度、脱杂时间、料液比等条件下，EDTA脱除矿物质杂质的效果和胶原蛋白的流失情况。

1.2.6 酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白工艺的优化 分别称取1 g鱼鳞，在20 ℃下用10 mL 0.1 mol/L的NaCl溶液浸泡2 h，用去离子水洗净沥干，在20 ℃下用20 mL 0.3 mol/L的EDTA溶液浸泡3 h，再用去离子水洗净沥干后，在不同浓度柠檬酸、酶用量、提取时间、提取温度条件下，利用酸酶复合法提取鱼鳞中的胶原蛋白，以提取液中羟脯氨酸的含量为评价指标，确定最佳提取工艺条件。

2 结果与分析

2.1 羟脯氨酸标准曲线的绘制

根据比色法测定不同浓度Hyp标样的吸光度，以Hyp标准品溶液浓度为横坐标，测定的吸光度为纵坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线如图1所示，其回归方程为y=0.208 8x+0.01 7，R2=0.999 3，表明当羟脯氨酸浓度在0～2.0 μg/mL之间时，与吸光度值具有良好的线性关系。

2.2 鱼鳞中杂蛋白脱除工艺的优化

鱼鳞中的蛋白质占总重量的70%，主要为胶原蛋白和鱼鳞角蛋白两大类，在提取胶原蛋白时需要先将鱼鳞中的其他杂蛋白去除，以提高提取效率。

以NaCl浓度、脱杂温度、脱杂时间、料液比为因素，进行L9（34）正交试验分析，结果如表1所示。表1中280 nm处测得的吸光度表征杂蛋白的溶出量，560 nm处测得的吸光度表征羟脯氨酸的溶出量，可以看出脱杂因素对脱杂效果的影响大小顺序为料液比、脱杂温度、脱杂时间、NaCl浓度，综合分析选择料液比1∶10、脱杂温度20 ℃、脱杂时间2 h、NaCl浓度0.1 mol/L为最佳杂蛋白的脱除工艺条件，此时的杂蛋白脱除率较高，且羟脯氨酸的溶出量也相对较低。

2.3 鱼鳞中矿物质脱除工艺的优化

鱼鳞具有富集周围环境中重金属的作用，在提取胶原蛋白之前要去除鱼鳞中的金属离子（以钙离子含量最高）。因为EDTA具有螯合大部分金属离子的作用，选择EDTA来脱除矿物质，以EDTA浓度、脱杂温度、脱杂时间、料液比为因素，进行L9（34）正交试验分析，结果如表2所示。以脱除液中的钙含量表征EDTA脱除矿物质杂质的效率，用560 nm处测得的吸光度表征羟脯氨酸的溶出量。从表2中可以看出，各因素对鱼鳞中矿物质脱除效果的影响大小顺序为料液比、EDTA浓度、脱杂时间、脱杂温度，综合分析选择料液比1∶30、提取温度20 ℃、脱杂时间3 h、EDTA浓度0.3 mol/L为最佳矿物质的脱除工艺条件，此时不但矿物质的脱除率较高，且羟脯氨酸的溶出量也相对较低。

2.4 柠檬酸浓度对酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白效果的影响

将经过脱杂预处理的鱼鳞样品分别加入1%、3%、5%、7%的柠檬酸，再加5%鱼鳞质量的胃蛋白酶，置于30 ℃恒温水浴中反应5 h后，测定提取液中羟脯氨酸含量，结果如图2所示。从图2可以看出，随着柠檬酸浓度的增加，胶原蛋白的提取效率（用羟脯氨酸提取量来表征，下同）先增加后下降，酸浓度的增加有利于胶原蛋白的溶出，但是过高的酸浓度可能导致胶原蛋白分子结构的变化，提取效率反而降低，因此，选择柠檬酸浓度为3%。

2.5 酶用量对酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白效果的影响

将经过脱杂预处理的鱼鳞样品分别加入3%、5%、7%、9%鱼鳞质量的胃蛋白酶，3%的柠檬酸溶液，置于30 ℃恒温水浴中反应5 h后，测定提取液中羟脯氨酸含量，其结果如图3所示。从图3可以看出，随着酶用量的增加，胶原蛋白的提取效率逐渐增加，说明酶的加入有利于胶原蛋白的溶出，但当酶用量大于7%以后再增加酶用量，提取效率变化不大，因此选择最佳的酶使用量为鱼鳞质量的7%。

2.6 温度对酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白效果的影响

将经过脱杂预处理的鱼鳞样品加入3%的柠檬酸溶液、5%鱼鳞质量的胃蛋白酶，分别置于20、25、30、40 ℃的恒温水浴中反应5 h后，测定提取液中羟脯氨酸含量，结果如图4所示。从图4可以看出，随着提取温度的升高胶原蛋白提取效率总体呈上升趋势，但由于淡水鱼鱼鳞胶原蛋白的变性温度一般低于30 ℃，为保证胶原蛋白的生物活性，选择25 ℃为适宜的提取温度。

2.7 时间对酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白效果的影响

将经过脱杂预处理的鱼鳞样品加入3%的柠檬酸溶液、5%鱼鳞质量的胃蛋白酶，置于25 ℃恒温水浴中分别反应2、3、4、5、6、8 h后，测定提取液中羟脯氨酸含量，结果如图5所示。从图5可以看出，随着提取时间的增加，胶原蛋白提取效率随之上升，当提取时间大于6 h时，提取效率变化不大。因此，选择适宜的提取时间为6 h。

2.8 酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白的正交试验结果

以柠檬酸浓度、酶用量、提取时间为酸酶复合法提取鱼鳞胶原蛋白的影响因素，进行L9（33）正交试验分析，结果如表3所示，表中以羟脯氨酸的提取量表征酸酶复合法提取胶原蛋白的效率。从表3可以看出，酸酶复合法提取胶原蛋白的工艺中各因素对胶原蛋白提取效果的影响大小顺序是柠檬酸浓度、酶用量、提取时间。

结合单因素试验和正交试验分析，酸酶复合法提取胶原蛋白的最佳提取工艺条件：柠檬酸浓度为3%、酶用量为鱼鳞质量的7%、提取时间6 h、提取温度25 ℃（室温），此时羟脯氨酸的提取量为2.395 μg/g。

3 讨论

提取鱼鳞中胶原蛋白时最常遇到的问题就是提取效率较低，其主要原因一是鱼鳞组织在生长时，胶原蛋白与蛋白多糖和糖蛋白的特异亲和性，使胶原蛋白呈不溶性；二是组织生长过程中，胶原分子间形成纤维化连接，或胶原蛋白分子与其他成分之间形成共价键[一般位于胶原分子N及C端的非胶原（端肽）部分]，阻碍了胶原蛋白的提取[11，12]。为提高胶原蛋白的提取效率可以从两个方面优化其工艺，一方面是通过对提取原料的脱杂处理，去除杂蛋白及矿物质（钙）杂质等。鱼鳞中胶原纤维分子间和分子内交联的共价键和非共价键使其结构很稳定，需进行前处理以打破上述稳定结构，使胶原分子得以释放，同时除去鱼鳞中的杂蛋白。常用的脱杂蛋白脱除剂主要有NaOH、NaCO3和NaCl，浸泡液碱性越高对杂蛋白的脱除效果越好，但过高的浓度反而会使鱼鳞中的胶原蛋白发生溶解，从而造成损失[1，13]。本试验采用NaCl脱杂，既能保证有效地脱除杂蛋白，又能保证胶原蛋白的流失率相对较低；鱼鳞主要由表层的钙化层和内部的胶原纤维层构成，为提取鱼鳞胶原蛋白，首先要脱除鱼鳞表面的钙化层，脱钙方法主要有盐酸脱钙法和EDTA脱钙法[14-16]，使用盐酸脱钙会造成胶原蛋白的大量损失[17]，本试验选用EDTA脱钙，既保证钙杂质的脱除，又能保证较少的胶原蛋白损失。

另一方面是优化提取方法，目前，胶原蛋白的提取方法主要有以下4种，即热水提取法、盐法、酸法和酶法，这些方法繁琐、时间长、成本高[18]。有研究用酶解法与热水提取法结合、酸法与热水提取法相结合等方法来提高提取率，但胶原蛋白在高温下容易变性，在40 ℃下容易导致三螺旋结构破坏，60 ℃容易导致某些共价键断裂分解，造成损失[19-21]；也有研究采用超高压热水提取法，但设备昂贵，设备容积小，难以实现工业化[22]。本试验采用柠檬酸结合胃蛋白酶的方法进行胶原蛋白的制备，经济便捷，酸提取可将没有交联的胶原分子溶解出来，也可溶解含有醛胺类交联键的胶原纤维，常用的酸有柠檬酸、乙酸、盐酸、乳酸和磷酸等，柠檬酸酸性适中，而且满足食品等工业加工的需求；酶提取可使不溶于酸溶液的相互交联的胶原分子分散为可溶性的胶原单分子或相对细小的胶原微纤维，同时还可以切断端肽的共价键，使胶原分子的螺旋结构完整地保留下来。本试验采用酸酶复合法制备胶原蛋白，不仅可以保证胶原蛋白的完整性，还有助于提高其产率。

由于鱼鳞胶原蛋白对热不稳定，高温下易变性，且呈现出鱼种特异性，即暖水性鱼类的鱼鳞胶原蛋白比冷水性鱼类的变性温度略高，这在提取不同鱼类鱼鳞胶原蛋白时需要特别注意。

4 小结

以鱼鳞为原料通过NaCl脱除杂蛋白，EDTA脱除矿物质，然后再以柠檬酸和胃蛋白酶为提取介质提取胶原蛋白。研究表明，NaCl既能保证有效地脱除杂蛋白，又能保证胶原蛋白的溶出量相对较低；EDTA既能保证钙杂质的脱除，又能保证较少的胶原蛋白损失；将柠檬酸和胃蛋白酶结合提取胶原蛋白，不仅可以保证胶原蛋白的完整性，还有助于提高产率，且影响鱼鳞胶原蛋白提取效率的主要因素分别为柠檬酸浓度、酶用量、提取时间。

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