陆地棉棉酚合成关键基因杜松烯合酶基因克隆及序列差异分析

王志伟　张艳　薛薇　张桂寅

摘要：利用同源克隆法克隆获得有酚陆地棉（Gossypium hirsutum）杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase） 基因。结果表明，该基因长ORF为1 665 bp，编码551个氨基酸，具有类戊二烯的保守结构域，有酚和低酚陆地棉之间，该基因存在序列差异。

关键词：陆地棉（Gossypium hirsutum）；杜松烯合酶；克隆；差异序列

中图分类号：S562 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2114-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.051

Abstract： The gene named Delta-cadinene sythase in this study was obtained from using homology-based cloning method for cloning. The results showed that this gene contained an ORF of 1 665 bp in length encoding 551 amino acids with the conservative domain structure of class pentadiene.Between low phenol and phenolic G. hirsutum， the gene exist sequences of differences.

Key words： Gossypium hirsutum； Delta-cadinene sythase； clone； sequence of variance

棉花是重要的经济作物，不仅是优质天然纤维的主要来源，而且种子中含有极为丰富的蛋白质。棉子蛋白是优质的蛋白质原料，可以提高动物生产性能，降低饲料成本[1]。中国每年有1 000万t以上的棉子，年产棉子饼、粕达600万t以上[2]。根据资料中国棉花棉子蛋白质含量为22%～24%[3]，是世界上仅次于大豆的重要植物蛋白质资源。目前全球大面积栽培的棉花品种主要是陆地棉（Gossypium hirsutum），其种仁含有棉酚及其衍生物，人及非反刍动物食用后会出现中毒现象，轻则头晕、呕吐，重则引起死亡。通过选育无腺体性状已获得无酚或低酚棉花品种，并已取得卓越成效，实践证明采取控制腺体性状来控制棉酚是很有效的策略[4]。然而从分子生物学角度，如何调控棉酚，探索棉酚与腺体之间的关系，达到有效控制棉酚和腺体，这都是亟待解决的问题。棉酚是倍半萜次生代谢物质，其生物合成代谢是异戊二烯途径，其中倍半萜环化酶—杜松烯合酶（Delta-cadinene sythase）是该途径的关键酶之一[5，6]。本研究拟采用同源克隆结合棉花D基因组序列克隆陆地棉参与棉酚合成的关键酶，为弄清棉酚与腺体形成的机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

棉花幼苗采用无菌培养。精选大小均匀、无病虫害的棉花种子，用0.1%的升汞消毒8 min，蒸馏水冲洗干净，种植于装有MS培养基的锥形瓶中。培养室温度控制在昼温25 ℃，夜温20 ℃，光照周期12 h，光照度5 000 lx。

待棉花幼苗子叶完全展开时，选取生长健壮、大小均匀一致的植株进行取样。称取0.1 g用0.1% DEPC水冲洗干净，在液氮中充分研磨后置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 总RNA的提取与cDNA的合成

取保存的样品，采用EASYspin RNA快速提取试剂盒（重庆波尔公司）提取总RNA，具体步骤参照试剂盒说明书。采用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，琼脂糖凝胶（1.2%）电泳检测RNA的质量。采用ReverTra Are qPCR RT Master Mix with gDNA Remover （TOYOBO）试剂盒，按照试剂盒说明书操作合成第一链cDNA，用于基因克隆。

1.3 种子序列及基因全长的获得

1）利用已经发表的其他物种上相关基因的序列，采用Blast程序在NCBI网站进行棉花EST数据库比对，寻找出高度同源的序列，将同源序列进行拼接组装成重叠群（Contig）。

2）以重叠群为种子序列，再次Blast检索棉花的EST数据库和序列组装，延伸重叠序列，重复上述过程，直至没有新的EST检出即重叠群序列不再延伸，从而生成最终的最长新生序列。将新获得的种子序列与公共数据库棉花D基因组比对，找到该序列对应的基因全长，以该全长序列为参考设计引物，以陆地棉cDNA为模版扩增，并通过测序获得目的基因全长序列。

1.4 目的基因的PCR扩增

以上述反转录得到的棉花cDNA为模版，进行PCR扩增。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸105 s，23個循环；72 ℃延伸10 min。将PCR 扩增目的条带回收纯化后pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌TOP10，挑取阳性克隆、提取质粒，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

1.5 目的基因的生物信息学分析

通过 NCBI 的ORF finder寻找杜松烯合酶基因的开放读码框，通过Blast和CDD 数据库分析氨基酸序列和结构域；通过ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析蛋白质的等电点、相对分子质量等理化性质；利用SignalP3.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/）进行信号肽分析；在NCBI数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）和中国农业科学院棉花研究所棉花基因组数据库（http：//cgp.genomics.org.cn/page/cn/index.jsp）中Blast杜松烯合酶基因的同源基因，并进行序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 RNA提取与cDNA的合成

对提取的RNA进行1.2%的琼脂糖电泳检测，上样量为1 μL，从图1中可以看出，28 s RNA、18 s RNA特征谱带无拖尾现象，比例约为2∶1，RNA完整，无降解，质量高，符合试验要求。反转录cDNA主要集中在250～1 500 bp（图2），说明质量较好，可用于后续试验。

2.2 杜松烯合酶全序列的克隆

基于cDNA全序列设计引物，PCR扩增后获得了1 851 bp的目的片段（图3），其中包括1 665 bp的开放读码框（ORF），29 bp的5UTR和157 bp的3UTR。经测序分析该全序列与拼接序列完全相同，其中包括1 665 bp的ORF区域。

2.3 杜松烯合酶氨基酸序列及保守结构域分析

生物信息学分析表明，该基因编码551个氨基酸残基（图4），具有类戊二烯的保守结构域，表明克隆得到的序列为杜松烯合酶基因序列。

2.4 杜松烯合酶基因的生物信息学分析

通过在线ProtParam分析杜松烯合酶蛋白质的理化性质，推测其分子式为C2865H4413N759O860S24，相对分子质量约为64 ku，理论等电点（pI）为5.3。SignalP3.0信号肽分析显示该基因内部没有信号肽，如图5所示。

2.5 有酚与低酚陆地棉种杜松烯合酶基因的序列差异比较

将克隆得到的杜松烯合酶基因与数据库中来自于低酚陆地棉的该基因（U88318.1）进行序列比较，发现2个基因存在序列差异，如图6所示。推测这些序列内部的差异位点对有酚和无酚棉种基因功能具有重要作用。

3 小结与讨论

由于棉子只是棉花生产的副产品，长期以来，棉花育种围绕棉纤维产量和品质展开。开展棉子营养品质的研究与改良还很有限，加上常规育种存在检测成本高及检测效率低等不足，利用基因工程手段结合常规育种可以对棉子品质改良带来更广阔的前景[7]。

本研究通过同源克隆法获得了有酚陆地棉棉酚合成酶关键基因—杜松烯合酶基因的cDNA全序列，通过Blast分析发现该基因编码一个含有551氨基酸残基的多肽，保守结构域分析显示其具有类戊二烯的保守结构域。有酚与低酚陆地棉中序列差异比对发现，杜松烯合酶基因在二者间具有高度的同源性（99.16%），但也存在序列间的多态性，这些位点的变异可能是导致2个棉花品种在棉酚合成方面的不同。

参考文献：

[1] BLACKWELDER J T，HOPKINS B A，DIAZ D E，et al. Milk production and piasma gossypol of cows fed cottonseed and oilseed meals with or without rumen-undegradadle protein[J]. Journal of Dairy Science，1998，81：2934-2941.

[2] 李爱科，郝淑红，伍松陵.植物蛋白质饲料资源开发利用新技术研究进展[J].饲料与畜牧，2006（10）：5-9.

[3] 邱新棉.试论低酚棉资源及其利用前景[J].中国棉花，2000，27（2）：7-9.

[4] 夏正俊，顾本康，吴蔼民，等.棉花品种抗黄萎病性与体内生化成分相关分析[J].植物保护学报，1994，21（4）：305-310.

[5] 许智宏，陈晓亚.植物生物技术原理-植物次生代谢途径及其调控[M].北京：科学出版社，1998.

[6] 余叙文，陈晓亚.植物生理与分子生物学[M].北京：科学出版社，1999.

[7] 朱乾浩，俞碧霞，许馥华.低酚棉棉籽品质性状的遺传分析[J].棉花学报，1995，7（2）：94-99.