金银花叶提取物对棘胸蛙烂皮病治疗效果的探讨

王瑞君　熊筱娟　李志元

摘要：研究了金银花（Lonicera japonica）叶不同溶剂提取物对棘胸蛙（Rana spinosa）烂皮病治疗效果的影响。首先制备金银花叶的水提物与醇提物，分別用终浓度为16 mg/mL的水提物和醇提物浸浴患病蝌蚪，比较蝌蚪的存活量和平均体重。结果表明，金银花叶醇提物治疗组的蝌蚪存活数量远高于金银花叶水提物治疗组。说明金银花叶的醇提物对患病蝌蚪有较好的治疗效果。

关键词：金银花（Lonicera japonica）叶；醇提物；水提物；棘胸蛙（Rana spinosa）；烂皮病

中图分类号：R284；S947.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2055-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.034

Abstract： In this study the treatment effect of different extracts from Leaves of Lonicera japonica on skin ulceration disease of Rana spinosa were compared. The water extracts and ethanol extracts from Leaves of Lonicera japonica were used on sickened tadpoles with the final concentration of 16 mg/mL.The results showed that the survival number of tadpoles in ethanol extracts group was significantly higher than the water extracts group.It indicated that the ethanol extracts from Lonicera japonica leaves has a good treatment effect on the sickened tadpoles.

Key words： Lonicera japonica leaves；ethanol extract；water extract；Rana spinosa；skin ulceration disease

棘胸蛙（Rana spinosa）是中国主要的养殖蛙之一，俗称石蛙、石鸡等。在中国，野生棘胸蛙主要分布在江西、福建、云南、江苏、浙江、湖南等地。棘胸蛙因肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富而备受百姓青睐。资料显示[1]，棘胸蛙肉质含有人体必需的8种氨基酸，具有重要的食用药用价值，是重要的保健滋补品。

棘胸蛙主要栖息在水质清澈的流动水体中。但是，在棘胸蛙养殖中，由于养殖密度大、水体流动性差、残留饵料易腐败等原因而易患病。蝌蚪期与成蛙所患疾病主要有红腿病[2]、烂皮病[3]、轮虫病[4]等，或两种以上疾病同时发生。如以抗生素治疗蛙病，易造成水体、土壤等周围环境的二次污染，易导致耐药病原体的传播，也易使蛙类食品中出现抗生素残留而不符合食品要求。而中草药具有安全、无污染、副作用小等优点，可以应用于蛙类疾病的治疗中。本试验旨在探讨中草药金银花叶提取物对棘胸蛙烂皮病的治疗作用，以促进棘胸蛙人工养殖的健康发展，提供安全的棘胸蛙食品。

金银花（Lonicera japonica）为忍冬科忍冬属植物，具有抗菌、消炎、解毒、清热、保肝等功效，广泛应用于医药、保健食品等方面。但一般利用金银花的花蕾，金银花的叶一般被看做副产物。现有研究资料表明[5]，金银花叶的化学成分与花类似，只是同一成分在不同部位的含量可能有所不同。研究发现[6]，相同中药不同溶剂提取物的抑菌活性不同。本试验探讨了金银花叶不同溶剂提取物对患烂皮病棘胸蛙蝌蚪治疗效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 石蛙蝌蚪 三高绿箭石蛙养殖基地提供。

1.1.2 金银花叶 购于江西省宜春金银花培养基地。

1.1.3 其他主要试剂及仪器 乙醇（国药集团AR）、微型植物粉碎机（FW177型，天津泰斯特仪器有限公司）、旋转蒸发仪（RE3000A型，上海亚荣生化仪器厂）、蒸馏器（YN-ZD-20型，上海博迅实业有限公司）等。

1.2 方法

1.2.1 金银花叶提取物的制备

1）金银花叶水提物的制备。精确称取1.6 kg金银花叶，粉碎，蒸馏水浸泡，密封，室温放置4 h。水浴加热回流1 h。滤渣加水做第二次加热回流30 min。重复2次。3次滤液混合，用旋转蒸发仪浓缩至生药浓度为0.8 g/mL。

2）金银花叶醇提物的制备。精确称取金银花叶1.6 kg，粉碎，75%乙醇浸泡，密封后室温放置4 h。75%乙醇回流1 h。滤渣中加75%乙醇，回流30 min。重复2次。3次滤液混合后浓缩至生药浓度为0.8 g/mL。

1.2.2 蝌蚪分组与处理 患病蝌蚪的主要症状为白鳍、皮肤有溃烂，为典型的烂皮病症状。随机取正常和患病蝌蚪分为4组，每组99尾。

1）正常对照组：随机挑取健康无病的蝌蚪99尾，称重，计算每尾平均体重。正常喂养24 h后进入正式试验。每天上午7：00～8：00时间段内，蛙池内水停止流动，水总量为100 L。8：00后，水体恢复为通常流速，蝌蚪正常喂养，连续进行3 d。第四天改为正常换水和喂养，连续进行7 d。7 d后，即第11天上午称量蝌蚪体重，计算每尾蝌蚪平均体重。

2）患病对照组：随机挑取患病蝌蚪99尾，称重，计算每尾平均体重。分组完毕，同样是正常喂养24 h后，进入正式试验。试验过程同正常对照组。

3）治疗1组（金银花叶水提物治疗组）：随机挑取患病蝌蚪99尾，称重，计算每尾平均体重。分组完毕，正常喂养24 h后进入正式试验。每天上午7：00～8：00時间段内，蛙池内水停止流动，加入金银花叶水提物治疗，溶液终体积为100 L，生药终浓度为16 mg/mL。8：00后，恢复常规换水和喂养，连续进行3 d。第四天停止用药，按常规换水和喂料，连续进行7 d。第11天上午称量蝌蚪体重，计算每尾蝌蚪平均体重。

4）治疗2组（金银花叶醇提物治疗组）：随机挑取患病蝌蚪99尾，称重，计算每尾平均体重。分组完毕，正常喂养24 h后进入正式试验。每天上午7：00～8：00时间段内，蛙池内水停止流动，加入金银花叶醇提物治疗，溶液终体积为100 L，生药终浓度为16 mg/mL。8：00后，恢复为常规换水和喂养，连续进行3 d。第四天改为常规换水和喂料，连续进行7 d。第11天上午称量蝌蚪体重，计算每尾蝌蚪平均体重。

1.2.3 数据分析 采用Spss17.0软件进行统计学分析，组间比较采用t检验。

2 结果与分析

由表1可见，连续用药3 d后，治疗1组蝌蚪存活数量低于治疗2组与正常对照组（P﹤0.05），但高于患病对照组。停止用药7 d后（第11天）的数据表明，治疗1组蝌蚪死亡数高于治疗2组与正常对照组（P﹤0.01），但低于患病对照组（P﹤0.05）。治疗2组虽然有蝌蚪死亡，但与正常对照组相比差异不显著（P>0.05）。

为防止捕捞等人为外力干扰影响蝌蚪的生长和治疗，在治疗3 d后并没有对蝌蚪称重，只是在试验的开始和结束后称量蝌蚪的体重。由图1可见，治疗2组蝌蚪平均体重的增加值高于治疗1组，与正常对照组相比差异不显著。结果表明，金银花叶醇提物的治疗效果显著优于金银花叶水提物。

3 小结与讨论

本研究结果表明，金银花叶对棘胸蛙蝌蚪病原体具有抑制作用。一些相关文献的体外试验也得出了类似的结论。李世传等[7]报道金银花叶对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有抑制作用。赵彦杰[8]的研究结果显示，金银花叶提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、青霉、黄曲霉、黑曲霉和酿酒酵母等细菌和真菌均有一定的抑制作用。金银花叶对病原体具有抑制作用，可能与其含有与花蕾相似的化学成分有关[5]。有关金银花叶抑菌作用的研究主要集中于体外抑菌试验，有关动物体内的试验研究鲜有报道。

本试验结果显示，金银花叶醇提物的治疗效果优于水提物，与相关文献的研究结果一致。刘丽等[6]报道南五味子的乙醇提取物对所研究的8种致病菌的抑制作用最强；杨卫东等[9]在研究不同溶剂对竹叶提取物抑菌作用的影响时发现，乙酸乙酯的提取物抑菌效果最好，丙酮次之，水提取物的抑菌效果不明显。一般认为金银花植物中抗菌成分主要为绿原酸、黄酮等[10]。金银花叶的醇提物对患烂皮病棘胸蛙蝌蚪有较好的治疗效果，其原因可能是绿原酸、黄酮类物质更易被乙醇等有机溶剂提取出来。有关棘胸蛙的病原体研究较少。在蛙类的红腿病、烂皮病等疾病中常见的病原体有变形杆菌[11]、嗜水气单胞菌[12]等。本研究中棘胸蛙蝌蚪具有白鳍、皮肤溃烂等烂皮病的典型症状，但具体由何种病原微生物引起相关症状还有待进一步研究。

金银花叶一年四季皆有，采集方便，产量远高于花蕾。本试验结果为扩大金银花叶的开发利用提供了有益的借鉴。用金银花叶等中草药治疗棘胸蛙疾病，减少了抗生素的使用，保证了食品的安全。

参考文献：

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[3] 陈世濂，张艳璇，刘浩官.棘胸蛙病害因子的调查与分析[J].动物学杂志，1995，30（3）：9-12.

[4] 韩晓萍，张年福，廖茂勇，等.棘胸蛙蝌蚪的常见疾病防治[J].江西畜牧兽医，2014（1）：60-61.

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[7] 李世传，熊建华，罗秋水，等.不同干燥方法对金银花叶成分和抑菌效果的影响[J].中国食品学报，2012，12（12）：78-83.

[8] 赵彦杰.金银花叶提取物的抑菌效果研究[J].食品科学，2007， 28（7）：63-65.

[9] 杨卫东，费学谦，王敬文.不同溶剂对竹叶提取物抑菌作用的影响[J].食品工业科技，2006，27（1）：77-79.

[10]乌 兰，张泽生.金银花中绿原酸的提取及检测[J].食品科学， 2005，26（6）：130-134.

[11] 王瑞君，熊筱娟.棘胸蛙烂皮病奇异变形杆菌的分离、鉴定及对药物敏感性研究[J].淡水渔业，2012，42（4）：31-34.

[12] 马有智.棘胸蛙嗜水气单胞菌的生物被膜特性[J].浙江农业科学，2013（7）：894-896.