心包积液—肝坏死综合征高免卵黄抗体的研制

李新正　黄安群　陈理盾　姬向波　肖曙光　靳双星　黄炎坤

摘要：采取心包积液-肝坏死综合征病鸡的肝脏匀浆冻融，接种SPF鸡胚，制备尿囊液灭活水苗，用两种免疫程序对产蛋鸡进行免疫，用琼脂扩散试验检测其卵黄抗体水平，制备高免卵黄抗体。经中和试验和临床试验，结果显示高免卵黄抗体对该病的预防和治疗效果明显。

关键词：心包积液-肝坏死综合征；组织灭活水苗；卵黄抗体；回归试验；中和试验

中图分类号：S855.3；S858.31 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）08-2053-02

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.08.033

Abstract： In this study， the liver homogenate from the sick chicken with pericardial effusion-hepatic necrosis syndrome was inoculated to SPF chicken embryo to prepare allantoic fluid inactivated vaccine after three times freezing and thawing. Two procedures were employed to immune the hens. Then， agar gel precipitation（AGP） was used to test the antibody level in yolk and prepared the yolk antibody. The neutralization test and clinical test identified that yolk antibody showed an obvious effect on preventing and curing for the disease.

Key words： pericardial effusion-hepatic necrosis syndrome. inactivated vaccine； yolk antibody； animal test； neutralization test

心包积液-肝坏死综合征是由I群禽腺病毒引起[1]，近階段该病在河南、山东、河北、安徽、山西等省大面积流行，死亡率在10%～30%，严重时可达80%，且该病的发生呈上升趋势，已成为危害蛋鸡、肉鸡生产的主要传染病[2-6]。该病发病急、病程短，且无特效治疗药物，国内无特异性疫苗。为此，研制抗心包积液-肝坏死综合征卵黄抗体对发病鸡群进行治疗成为主要控制途径。对研制的心包积液-肝坏死综合征卵黄抗体的安全性、效价及治疗效果进行了研究，旨在为其临床应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 材料

试验动物：150日龄海兰褐蛋鸡300只（河南牧业经济学院试验鸡场提供）；SPF种蛋和SPF30日龄雏鸡由中外合资山东济南帕斯家禽有限公司提供；鸡心包积液-肝坏死综合征灭活苗和阳性血清，由河南牧业经济学院动物保健实验室制备。

1.2 方法

1.2.1 鸡心包积液-肝坏死综合征灭活水苗制备

取典型病例的肝脏组织，用生理盐水以1∶10（m/V）制成组织匀浆液，反复冻融3次，3 000 r/min离心20 min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，取0.1 mL滤液尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，在37.8 ℃孵化箱内继续孵化，15日龄收取尿囊液，用1%甲醛灭活48 h，制成灭活水苗。

1.2.2 阳性血清的制备 取1.2.1制备的灭活水苗注射30日龄SPF雏鸡，每只0.5 mL，颈部皮下注射，间隔10 d后再次免疫注射1 mL/只，2周后采血分离血清。

1.2.3 动物回归试验 取接种过心包积液-肝坏死综合征病料的SPF鸡胚尿囊液，接种10只30日龄SPF雏鸡，颈部皮下注射0.2 mL/只，对照组10只注射生理盐水0.2 mL/只，分别饲养在负压隔离笼内，观察一周。

1.2.4 高免试验 试验分为3组，每组100只150日龄产蛋母鸡，分别为试验1组、试验2组和对照组，在同一饲养环境和饲养标准下饲养。试验前用鸡沙门氏支原体全血平板凝集试验淘汰阳性鸡。试验1组为第一天注射灭活水苗1 mL/只，首免7 d后再注射2 mL/只；试验2组第一天注射生理盐水1 mL/只，首免7 d后再注射灭活水苗1 mL/只。对照组注射等量生理盐水。二免后5 、10、15、20 d，每组选5只鸡进行翅静脉采血，用琼脂扩散试验测定其血清中抗体效价。

1.2.5 中和试验 选取30日龄SPF雏鸡30只，分为3组，每组10只，分别为试验I组、试验II组和对照组。试验I组注射含心包积液-肝坏死综合征病毒的尿囊液和心包积液-肝坏死综合征抗体1∶1（V/V）混合物（混合物作用30 min后注射），颈部皮下注射0.4 mL/只；试验II组颈部皮下注射含心包积液-肝坏死综合征病毒的尿囊液0.2 mL/只；对照组颈部皮下注射生理盐水0.2 mL/只，分别饲养在负压隔离笼内，观察试验鸡精神状态、采食、饮水、粪便等变化以及发病死亡情况。

1.2.6 高免卵黄抗体的制备 从高免试验的鸡群1组和2组所产鸡蛋中检测抗体，收集抗体效价达到5.00 lg2的鸡蛋作为高免蛋，储存于0～4 ℃冷藏柜保存，备用[7]。高免卵黄抗体制备流程：用清水清洗高免蛋，用0.05%新洁尔灭浸泡15 min，清水冲洗晾干，卵黄与生理盐水以1∶4（V/V）的比例混合，用组织捣碎机搅拌均匀，双层纱布过滤，抑菌处理：匀浆液加万分之一硫柳汞，充分混匀，分装，密封保存于-20 ℃冰箱。

1.2.7 成品检验 无菌检验：取成品0.2 mL，接种于营养琼脂培养基中，分别进行厌氧和需氧培养，37.8 ℃增殖培养3 d观察有无细菌生长。

1.2.8 临床应用试验 河南中牟某养鸡场饲养海兰褐商品代母鸡1万只（35日龄），发病4 d，每天死亡100多只，经临床和剖检诊断为心包积液-肝坏死综合征，用抗心包积液-肝坏死综合征卵黄抗体注射，胸部肌肉注射1 mL/只。

2 结果与分析

2.1 动物回归试验

试验组攻毒48 h后出现3只鸡精神差，羽毛松乱，鸡冠发白，皮肤发黄，拉黄色稀便，相继发病，发病率90%，一周内死亡6只，死亡率达60%。剖检心包内有大量的黄色渗出液；肺部淤血；肝脏肿大，边缘钝圆，色泽土黄，质地变脆，在肝脏上有出血和淡黄色坏死点；胆囊充盈，胆汁色淡，稀薄如水；脾脏肿大，有坏死点；肾脏肿大，发黄；腺胃出血。而对照组无一发病，处死剖检其内脏无异常。

2.2 高免卵黄抗体效价

该组织苗吸收快，注射后5 d即可产生抗体，试验1组二免后5 d抗体水平平均为3.20 lg2，最高可达4.00 lg2；10 d抗体水平平均为4.80 lg2，最高可达 6.00 lg2；15d抗体水平平均为5.40 lg2，最高可达6.00 lg2（表1），试验1组抗体水平明显高于试验2组。表明该卵黄抗体免疫2次效果较好，免疫后5 d可以有效保护鸡群不发病。经免疫后15 d可用其制备高免抗体。

2.3 中和试验结果

用心包积液-肝坏死综合征病毒尿囊液和心包积液-肝坏死综合征高免卵黄抗体中和30 min后注射SPF鸡，观察7 d，10只鸡均未发病，剖检其内脏器官无异常。而用含心包积液-肝坏死综合征病毒尿囊液接种的鸡出现发病和死亡，剖检出现典型心包积液-肝坏死综合征病理变化，对照组无任何症状和病理剖检变化。对发病鸡群用心包积液-肝坏死综合征卵黄抗体注射3 d后，鸡群停止发病和死亡，恢复正常。

2.4 无菌检验

生产出的高免卵黄抗体成品经细菌培养均未发现厌氧和需氧细菌生长。

2.5 临床应用

經走访中牟养殖户，对发病鸡群注射心包积液-肝坏死综合征卵黄抗体1 mL/只，3 d后鸡群停止发病和死亡，恢复正常。

3 小结与讨论

通过动物回归试验结果可以看出鸡心包积液-肝坏死综合征病毒可在9日龄鸡胚尿囊腔内增殖和传代，可用于疫苗生产中病毒扩增。该尿囊液灭活水苗吸收快，注射5 d后可产生抗体，比用油苗产生抗体效果快，可用于紧急免疫接种，接种15 d后可用于生产高免卵黄抗体，且抗体维持时间长，这与临床上用患该病的肝脏组织自制自家灭活水苗的治疗效果相一致。通过中和试验，说明抗心包积液-肝坏死综合征高免卵黄液具有中和抗原作用。鸡心包积液-肝坏死综合征高免卵黄抗体目前在国内尚属空白，在国内无疫苗防控情况下，使用高免卵黄进行预防和治疗是一种较好的防控方法。通过临床应用取得满意的效果，对于减少该病对养鸡业造成的损失起到了重要的作用。高免试验结果表明，试验1组和2组的免疫程序对血清抗体水平前期有一定影响，2周后抗体水平均达到25～26。1组产生免疫水平较高，而2组抗体水平偏低，建议制作心包积液-肝坏死综合征高免卵黄抗体至少免疫2次，且间隔1月重复免疫1次。从试验1组试验结果可看出，注射尿囊液灭活水苗产生免疫快，5 d即可产生抗体，可用于紧急免疫接种和预防治疗。心包积液-肝坏死综合征是I群禽腺病毒引起的，I群禽腺病毒有12个血清型[8-10]，对该病毒的分型有待进一步研究。

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